糙叶五加果实乙酸乙酯萃取部位化学成分及抗炎活性研究

李小军，金官佑，张晓丹，吴贤哲，金伦喆*，刘向前

1赣南医学院药学院 国家中药现代化工程技术研究中心客家中医药资源研究分中心，赣州 341000；2湖南中医药大学药学院，长沙 410208；3圆光大学药学院，益山 54538；4浙江理工大学生命科学与医药学院，杭州 310000

糙叶五加Acanthopanaxhenryi(Oliv.) Harms为中国特有的五加科五加属植物，广泛分布于湖南、甘肃、四川等地。湖南省中药材地方标准收载的“五加皮”就是以该植物的根皮入药，具有祛风湿、活血化瘀、壮筋骨等功效，主要用于治疗风湿痹痛、拘挛麻木、筋骨痞软、水肿、跌打损伤、疝气腹痛等[1]。然而，从资源可持续、合理利用的角度考虑，根皮入药为不可再生；而其地上部位包括叶、茎、花、果实为可持续再生资源。为了探究糙叶五加的地上各部位是否可以替代其根皮入药，我们课题组前期对其叶、茎、花进行了系统研究并作了相应报道[2-7]。目前为止，对其果实的研究鲜有报道[8]。基于此，我们首次对糙叶五加果实进行了物质基础研究，对糙叶五加果实甲醇提取物依次进行了石油醚(60～90)、乙酸乙酯、正丁醇萃取，基于LPS诱导的小胶质细胞BV2模型对各萃取部分进行抗神经炎活性筛选，对活性较好的乙酸乙酯萃取部分进行分离纯化。

1 仪器与材料

NMR波谱(1D和2D)测试采用JEOL JNM ECP-400核磁共振仪(日本，东京)；HMQC和HMBC实验参数设置分别为1JCH=140 Hz和nJCH=8 Hz；ESI-MS测试采用Q-TOF micro LC-MS/MS质谱仪(美国，Waters)；旋光度测试采用Jasco p-2000全自动数字旋光仪(日本，东京)；高相液相色谱仪为YL9100 HPLC系统(韩国，英麟)；正相和反相TLC采用Kieselgel 60 F254和RP-18 F254s(德国，默克)；常规柱色谱硅胶(Kieselgel 60，70～230目和230～400目，默克)；反相柱色谱材料YMC-C18(德国，默克)；Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自Gibco BRL Co.(Grand Island，NY，USA)；脂多糖(LPS)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、Griess试剂购自美国Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)；阳性对照紫铆因(butein)为韩国圆光大学药学院生药及天然产物研究室自制(HPLC纯度≥98.5%)；小鼠小胶质细胞BV2来源于韩国圆光大学Park Hyun教授实验室。

本实验样品于2015年10月份采自湖南省新化，经湖南中医药大学药学院刘向前教授和韩国圆光大学药学院金伦喆教授共同鉴定为五加科五加属植物糙叶五加Acanthopanaxhenryi(Oliv.) Harms的果实，标本保存于湖南省重点实验室中药新药研究与开发实验室，标本号为AHF20151025。

2 提取与分离

干燥的糙叶五加果实5 kg，粉碎至粗粉，以甲醇回流提取3次，合并提取液,浓缩后得总浸膏。总浸膏加入适量蒸馏水分散后依次用石油醚(60～90)、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取。回收溶剂，得石油醚萃取物(40 g)、乙酸乙酯萃取物(20 g)、正丁醇萃取物(100 g)。

分别以LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7和小胶质细胞BV2作为抗炎活性筛选模型，对上述三个萃取部分进行活性筛选。取抗炎活性较好的部位乙酸乙酯浸膏(20 g)经反相C18柱色谱，以甲醇-水(1 ∶4→1 ∶0，V/V)梯度洗脱，得13个组分Fr.E1～E13。Fr.E2(309 mg)经正相硅胶柱色谱反复纯化得化合物1(5.8 mg)。组分Fr.E3(500 mg)经正相硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇(20 ∶1→1 ∶1，V/V)梯度洗脱，得化合物2(6.0 mg)和3(61.0 mg)。Fr.E5(796 mg)经正相硅胶柱色谱分离，以正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，再经甲醇反复重结晶纯化，得无色针晶4(5.0 mg)。组分Fr.E8(1.3 g)先经正相硅胶柱色谱分离，以三氯甲烷-甲醇(7 ∶1→1 ∶1，V/V)梯度洗脱，得9个亚组分Fr.E8.1～E8.9。Fr.E8.4(125 mg)经硅胶柱色谱分离，以三氯甲烷-甲醇(10 ∶1，V/V)洗脱，得化合物5(41 mg)。Fr.E8.5(57 mg)经硅胶柱色谱分离，以三氯甲烷-甲醇(5 ∶1，V/V)洗脱，得化合物6(24 mg)。Fr.E8.2(126 mg)经反相C18柱色谱分离，以乙腈-水(1 ∶4，V/V)洗脱，再经甲醇重结晶，得无色针晶8(14 mg)。组分Fr.E6(2.0 g)先经反相C18柱色谱分离，以甲醇-水(1 ∶4→2 ∶3，V/V)梯度洗脱，得6个亚组分Fr.E6.1～E6.6；亚组分Fr.E6.4(1.4 g)再经正相硅胶柱色谱分离，以三氯甲烷-甲醇-水(3 ∶1 ∶0.1，V/V/V)洗脱，得7个亚组分Fr.E6.4.1～E6.4.7。Fr.E6.4.1(244 mg)经反复正相硅胶柱色谱分离纯化，以正己烷-乙酸乙酯(3 ∶1～1 ∶3，V/V)为流动相，再经正相制备薄层纯化(正己烷-丙酮=2 ∶3，V/V)，得化合物11(1.8 mg)、12(5.0 mg)、13(8.8 mg)。亚组分Fr.E6.4.1.4(26 mg)经C18-HPLC分离纯化，以甲醇-水为流动相，得化合物14(2.0 mg)和15(7.5 mg)。Fr.E6.4.2(99 mg)先经正相硅胶柱色谱，以三氯甲烷-甲醇(15 ∶1→10 ∶1，V/V)梯度洗脱，再经C18-HPLC分离纯化，以乙腈-水为流动相，得化合物7(2.1 mg)、10(2.5 mg)、17(2.5 mg)、18(2.3 mg)。Fr.E9(3.1 g)经硅胶柱色谱分离纯化，以正己烷-乙酸乙酯(3 ∶1→2 ∶1，V/V)为流动相，得化合物9(24 mg)。组分Fr.E10(1.9 g)先经硅胶柱色谱反复分离纯化，再经甲醇重结晶脱色素处理得化合物16(34 mg)。

图1 化合物1～18的化学结构Fig.1 Chemical structures of compounds 1-18

3 结构鉴定

化合物1无色针晶(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：9.53(1H，s，-CHO)，7.38(1H，d，J=3.6 Hz，H-3)，6.58(1H，d，J=3.6 Hz，H-4)，4.60(2H，s，-CH2OH)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：152.6(C-2)，123.4(C-3)，109.6(C-4)，161.9(C-5)，56.3(C-6，-CH2OH)，178.1(C-7，-CHO)。以上数据与文献[9]报道一致，故鉴定化合物1为5-羟甲基-2-糠醛。

化合物2白色粉末(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：7.84(1H，s，H-6)，2.31(3H，s，2-CH3)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：150.5(C-2)，141.6(C-3)，168.9(C-4，C=O)，144.5(C-5)，139.1(C-6)，13.2(C-7，-CH3)。以上数据与文献[10]报道一致，故鉴定化合物2为5-羟基麦芽酚。

化合物3无色针晶(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：7.45(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)，7.42(1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6)，6.79(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：121.8(C-1)，116.5(C-2)，150.2(C-3)，144.7(C-4)，122.7(C-5)，114.5(C-6)，169.1(C-7，-COOH)。以上数据与文献[11]报道一致，故鉴定化合物3为原儿茶酸。

化合物4无色针晶(甲醇)；UV254和365 nm均显亮蓝色荧光；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：7.85(1H，d，J=9.6 Hz，H-4)，7.09(1H，s，H-5)，6.76(1H，s，H-8)，6.20(1H，d，J=9.6 Hz，H-3)，3.90(3H，s，-OCH3)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：162.7(C-2)，151.7(C-7)，150.1(C-9)，145.8(C-6)，144.8(C-4)，111.3(C-3)，111.2(C-10)，108.7(C-5)，102.7(C-8)，55.5(-OCH3)。以上数据与文献[12]报道一致，故鉴定化合物4为6-甲氧基-7-羟基香豆素。

化合物5黄色粉末(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：8.05(2H，d，J=9.2 Hz，H-2′，6′)，6.88(2H，d，J=9.2 Hz，H-3′，5′)，6.38(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.24(1H，d，J=7.6 Hz，glc-H-1′′)，3.70～3.40(6H，m，H-2′′～6′′)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：157.2(C-2)，134.2(C-3)，178.2(C-4)，161.7(C-5)，98.6(C-6)，164.6(C-7)，93.5(C-8)，157.7(C-9)，104.4(C-10)，121.5(C-1′)，131.0(C-2′，6′)，114.8(C-3′，5′)，160.2(C-4′)，102.9(glc-C-1′′)，74.4(C-2′′)，76.7(C-3′′)，70.0(C-4′′)，77.1(C-5′′)，61.3(C-6′′)。以上数据与文献[13]报道一致，故鉴定化合物5为山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物6黄色粉末(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：8.06(2H，d，J=9.2 Hz，H-2′，6′)，6.89(2H，d，J=9.2 Hz，H-3′，5′)，6.41(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.21(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.10(1H，d，J=7.6 Hz，glc-H-1′′)，4.50(1H，d，J=1.2 Hz，rha-H-1′′′)，3.81(1H，dd，J=11.0，1.2 Hz，H-6′′a)，3.63(1H，m，H-6′′b)，3.70～3.20(8H，m，glc-H-2′′～5′′，rha-H-2′′′～5′′′)，1.12(3H，d，J=6.0 Hz，H-6′′′，rha-CH3)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：157.2(C-2)，134.2(C-3)，178.0(C-4)，161.6(C-5)，98.7(C-6)，164.7(C-7)，93.7(C-8)，158.2(C-9)，104.4(C-10)，121.4(C-1′)，131.1(C-2′，6′)，114.9(C-3′，5′)，160.2(C-4′)，103.4(glc-C-1′′)，74.4(C-2′′)，75.9(C-3′′)，70.2(C-4′′)，76.8(C-5′′)，67.3(C-6′′)，101.1(rha-C-1′′′)，70.8(C-2′′′)，71.0(C-3′′′)，72.6(C-4′′′)，68.4(C-5′′′)，16.6(C-6′′′，rha-CH3)。以上数据与文献[14]报道一致，故鉴定化合物6为山柰酚-3-芸香苷。

化合物10白色粉末(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：7.42(2H，m，H-3′，5′)，7.31(2H，m，H-2′，6′)，7.23(1H，m，H-4′)，6.70(1H，d，J=16.0 Hz，H-3)，6.39(1H，dt，J=16.0，6.4 Hz，H-2)，4.55(1H，ddd，J=12.8，5.7，1.6 Hz，H-1a)，4.37(1H，d，J=7.6，Hz，H-1″)，4.33(1H，ddd，J=12.8，6.5，1.4 Hz，H-1b)，3.89(1H，dd，J=13.2，1.6 Hz，H-6″a)，3.69(1H，m，H-6″b)，3.20～3.37(4H，m，H-2″～5″)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：69.4(C-1)，125.4(C-2)，132.5(C-3)，136.9(C-1′)，126.2(C-2′，6′)，128.2(C-3′，5′)，127.4(C-4′)，102.1(glc-C-1′′)，73.8(C-2′′)，76.7(C-3′′)，70.4(C-4′′)，76.8(C-5′′)，61.5(C-6′′)。以上数据与文献[18]报道一致，故鉴定化合物10为松香。

化合物11无色胶状物质(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CDCl3)δH：7.34(5H，m，H-2～6)，4.91(1H，d，J=11.6 Hz，H-7a)，4.61(1H，d，J=11.6 Hz，H-7b)，4.35(1H，d，J=8.0 Hz，H-1′)，3.53(1H，m，H-3′)，3.42(3H，m，H-2′，4′，5′)，4.45(1H，d，J=12.4 Hz，H-6′a)，4.30(1H，d，J=12.4 Hz，H-6′b)，2.11(3H，s，H3-1′′，CH3CO-)；13C NMR(100 MHz,CDCl3)δC：136.9(C-1)，128.3(C-2，6)，128.6(C-3，5)，128.2(C-4)，71.3(C-7)，101.6(glc-C-1′)，73.7(C-2′)，76.0(C-3′)，70.0(C-4′)，74.1(C-5′)，63.4(C-6′)，21.0(C-1′′，CH3CO-)，171.9(C-2′′，CH3CO-)。以上数据与文献[19]报道一致，故鉴定化合物11为苯甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷-6′-O-醋酸酯。

化合物16白色粉末(甲醇)；1H NMR(400 MHz,CD3OD)δH：5.23(1H，t，J=3.6 Hz，H-12)，4.38(1H，d，J=7.6 Hz，GluA-H′-1)，3.77(1H，d，J=10.0 Hz，GluA-H′-5)，3.50(1H，t，J=9.2 Hz，GluA-H′-4)，3.36(1H，t，J=9.6 Hz，GluA-H′-3)，3.34(1H，s，GluA-H′-2)，3.24(1H，m，H-3)，3.18(1H，dd，J=11.2，4.0 Hz，H-18)，0.80，0.84，0.90，0.93，0.94，1.05，1.16(each 3H，s，7 × -CH3)；13C NMR(100 MHz,CD3OD)δC：38.5(C-1)，25.7(C-2)，89.8(C-3)，38.9(C-4)，55.7(C-5)，18.0(C-6)，32.5(C-7)，39.3(C-8)，47.7(C-9)，36.6(C-10)，22.8(C-11)，122.4(C-12)，143.8(C-13)，41.6(C-14)，27.5(C-15)，23.2(C-16)，46.3(C-17)，41.4(C-18)，46.0(C-19)，30.3(C-20)，33.6(C-21)，32.7(C-22)，27.2(C-23)，15.7(C-24)，14.7(C-25)，16.4(C-26)，25.2(C-27)，180.5(C-28)，22.7(C-29)，32.3(C-30)，105.7(glc-C-1′)，74.0(C-2′)，76.4(C-3′)，71.9(C-4′)，75.2(C-5′)，171.4(C-6′)。以上数据与文献[24]报道一致，故鉴定化合物16为齐墩果酸-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。

4 活性测定

MTT法细胞毒性试验：取对数生长期BV2细胞接种于96孔板中(1×105个细胞/孔)，37℃、5% CO2条件下温孵培养12 h后，给药组分别加入不同浓度的待测样品(终浓度分别为5、10、20、40、80 μM)，同时每种药物均设加入或不加入LPS(1 μg/mL)两组。溶剂对照组均不加入受试药物及LPS，但加入体积分数为0.1%的DMSO。继续温孵培养12 h后，每孔取出100 μL上清液，加入终质量浓度为100 mg/mL的MTT工作液孵育0.5 h。形成的甲臜盐使用酸化异丙醇溶解，在酶标仪(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)540 nm处测定各孔吸光度(A)值，以正常组细胞(未处理)的A值所对应的细胞存活率为100%，计算细胞存活率。每组重复3次独立实验，结果见表1。

NO抑制试验：采用Griess法检测对LPS刺激下的BV2细胞分泌NO的抑制作用。取对数生长期BV2细胞接种于96孔板中(1×105个细胞/孔)，37 ℃、5% CO2条件下温孵培养12 h后加入100 μL不同浓度的待测样品(终浓度分别为5、10、20、40、80 μM)，温孵培养1 h后加入100 μL的LPS(1 μg/mL)，同时设模型组(LPS+培养液)、阳性对照组(紫铆因+LPS+培养液)、空白对照组(培养液)，继续温孵培养12 h。每组重复3次独立实验。将上清液(100 mL)与等体积的格氏试剂混合，用酶联免疫检测仪测定混合物在540 nm处的A值，计算NO抑制率，结果见表1。

表1 化合物1～18对LPS诱导的小鼠小胶质细胞BV2的细胞毒性和一氧化氮产生的抑制效果

注：每组数据均以三次独立的重复实验的平均值±SD表示。a化合物16在测试浓度达到 40～80 μM时具有较强的细胞毒性，测试抗炎结果无实际意义；在安全浓度范围0～20 μM且在5 μM浓度时，其表现出了相对较好的NO抑制效果，抑制率为20.6%。Note:Each group of data is represented by the mean ± SD of three independent repeated experiments.aCompound 16 shows strong cytotoxicity when the tested concentration reaches 40-80 μM,and it has no practical significance for the test of anti-inflammatory activity.In the safe concentration range of 0-20 μM and at 5 μM,it showed a moderate NO inhibition effect with the inhibition rate 20.6%.

5 结论

本文基于脂多糖(LPS)诱导的小胶质细胞BV2模型，首次对糙叶五加果实进行了抗炎活性导向下的化学成分研究，从抗炎活性较好的乙酸乙酯萃取部位中分离鉴定出了18个单体化合物，包括5个木脂素、4个单萜、2个黄酮苷、1个酚酸、1个香豆素、1个苯丙素苷、1个糠醛、1个麦芽酚类、1个苯甲苷和1个三萜苷，其主要成分类型为木脂素和单萜类；而其叶的化学成分研究，已报道了31个化合物，包括16个三萜皂苷、5个黄酮、6个咖啡酰基奎宁酸、1个蒽醌、1个脂肪酰胺苷、1个有机酸、1个甾体苷[2-5]，叶的主要成分为三萜皂苷、黄酮和咖啡酰基奎宁酸；前期研究中对糙叶五加茎报道了18个化合物，包括8个酚类、5个咖啡酰基奎宁酸类、2个植物甾醇、1个木脂素、1个香豆素、1个长链脂肪酸，其主要成分类型为酚类和咖啡酰基奎宁酸类；而对糙叶五加花报道的17个化合物中，包括9个咖啡酰基奎宁酸类、6个黄酮及其苷类、1个木脂素苷类、1个苯丙素苷类，其主要成分为二取代的咖啡酰基奎宁酸类及带有槲皮素或山奈酚母核的黄酮类。比较果实、叶、茎和花的化学成分发现，它们的物质基础均存在明显的差异，表明各不同部位有着不同的用途。

对所得的化合物进行抗炎活性筛选发现，被测试化合物均表现出了一定的一氧化氮(NO)抑制活性，其中，化合物1、4、7、9、12、13、18表现出了较好的抑制NO生成的活性，对于这些单体化合物的潜在抗炎活性研究有待进一步进行。本文进一步丰富了五加科五加属植物的研究内容，同时为中国特产植物糙叶五加的研究提供一定的参考和借鉴。