基于响应面法的大黄产地加工炮制一体化工艺研究

2020-05-16辛二旦司昕蕾边甜甜牛江涛张育贵张淑娟李越峰

中国中医药信息杂志 2020年5期

关键词：甲醚蒽醌芦荟

辛二旦，司昕蕾，边甜甜，牛江涛，张育贵，张淑娟，李越峰

论著·中药研究与开发

基于响应面法的大黄产地加工炮制一体化工艺研究

辛二旦1，2，司昕蕾1，2，边甜甜1，2，牛江涛1，2，张育贵1，2，张淑娟1，2，李越峰1，2

1.甘肃中医药大学，甘肃兰州 730000；2.甘肃省中药质量与标准研究重点实验室，甘肃兰州 730000

采用响应面法优选大黄产地加工与炮制一体化加工工艺。以大黄中芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷等11种化学成分含量的综合评分作为考察指标，以含水量、切制规格和干燥温度为考察因素，采用Box-Behnken响应面试验设计优化大黄的产地加工炮制一体化工艺。大黄产地加工炮制一体化最佳工艺条件为：含水量为35%，切制规格为2.5 mm，干燥温度为60 ℃。本研究优选的工艺简便易行，精确度良好，可用于大黄产地加工炮制一体化。

响应面法；大黄；产地加工炮制一体化；高效液相色谱法

大黄为蓼科植物掌叶大黄L.、唐古特大黄Maxim. ex Balf.或药用大黄Baill.的干燥根及根茎[1]。大黄始载于《神农本草经》，味苦寒，列为下品，具有“下瘀血，血闭寒热，破癥瘕积聚，留饮宿食，荡涤肠胃，推陈致新，通利水谷，调中化食，安和五脏”之功，广泛用于治疗大便秘结、痈肿、疔疮、血热妄行引起的各种出血等。现代研究表明，蒽醌类成分是大黄的重要活性成分，与大黄的药理作用密切相关，具有泻下、抗炎、抗肿瘤、保护心血管等药理作用[2-6]。

2015年版《中华人民共和国药典》规定，大黄秋末茎叶枯萎或次春发芽前采挖，除去细根，刮去外皮，切瓣或段，绳穿成串干燥或直接干燥，制成大黄药材，大黄药材除去杂质，洗净，润透，切厚片或块，晾干，得大黄饮片[1]。可见，从大黄药材到大黄饮片，需经过2次干燥、2次浸润过程，这将不可避免地导致大黄水溶性成分流失，导致药效下降。此外，甘肃等地大黄药材干燥方法多采用柴火熏干，存在以下问题：①大黄产地熏干需2个月左右，耗时长，工艺繁琐；②熏干需要大量柴火，破坏自然资源，污染生态环境；③大黄缓慢熏干干燥过程中容易出现糠心、发霉、变质、变色。为此，本试验以芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量的综合评分为指标，运用Box-Behnken响应面试验设计方法，将药材产地加工和饮片炮制合二为一，优选大黄产地加工炮制一体化工艺，并探讨产地加工炮制一体化大黄饮片的优势，为大黄饮片的质量控制及临床规范用药提供依据。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司），SB-5200 DTD超声清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），BT125D十万分之一分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司），101-2A电热鼓风干燥箱（天津泰斯特仪器有限公司）。

试验所需大黄样品采自甘肃省陇南市洮坪乡兴隆村，经甘肃中医药大学中药鉴定教研室王明伟副教授鉴定为蓼科植物2年生掌叶大黄L.的新鲜根。对照品芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷（批号PS010709）、大黄酸-8-O-葡萄糖苷（批号PS011174）、大黄素-1-O-葡萄糖苷（批号PS010701）、大黄酚-8-O-葡萄糖苷（批号PS010712）、大黄素-8-O-葡萄糖苷（批号PS01119）、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷（批号PS010713），成都普思生物科技股份有限公司，纯度≥98%；大黄酸（批号180208）、大黄素（批号180126）、芦荟大黄素（批号180226）、大黄酚（批号180518）、大黄素甲醚（批号180117），北京北纳创联生物技术研究院，纯度≥98%；甲醇（色谱纯，批号20180502）、85%磷酸（色谱纯，批号20160307），天津市大茂化学试剂厂。

2 方法与结果

2.1 指标成分含量测定

2.1.1 色谱条件

采用Agilent HC-C18（2）柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为0.1%磷酸-甲醇，梯度洗脱（0～15 min，40%～50%甲醇；15～30 min，50%～60%甲醇；30～50 min，60%～80%甲醇；50～80 min，80%～100%甲醇），流速1.0 mL/min，检测波长410 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。色谱图见图1。

注：A.结合型蒽醌混合对照品；B.游离型蒽醌混合对照品；C.供试品；1.芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷；2.大黄酸-8-O-葡萄糖苷；3.大黄素-1-O-葡萄糖苷；4.大黄酚-8-O-葡萄糖苷；5.大黄素-8-O-葡萄糖苷；6.大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷；7.芦荟大黄素；8.大黄酸；9.大黄素；10.大黄酚；11.大黄素甲醚

2.1.2 对照品溶液制备

精密称取芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷0.65 mg、大黄酸-8-O-葡萄糖苷1.21 mg、大黄素-1-O-葡萄糖苷0.28 mg、大黄酚-8-O-葡萄糖苷1.06 mg、大黄素-8-O-葡萄糖苷2.12 mg、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷1.02 mg，置于5 mL容量瓶中，70%甲醇定容至刻度，摇匀，配制成大黄结合型蒽醌混合对照品贮备液；精密称取芦荟大黄素2.33 mg、大黄酸2.12 mg、大黄素1.75 mg、大黄酚3.96 mg、大黄素甲醚1.66 mg，置于5 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，配制成大黄游离型蒽醌混合对照品贮备液[7]。

2.1.3 供试品溶液制备

精确称取样品粉末（过4号筛）1.0 g，置150 mL锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，30 ℃超声（频率40 kHz，功率200 W）40 min后，取出，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.4 线性关系考察

将上述混合对照品溶液分别梯度稀释为5个不同浓度，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，每次10 μL，记录各待测成分色谱峰面积，以峰面积为纵坐标，进样质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1。可见，各待测成分在相应进样范围内线性关系良好。

表1 11种蒽醌类成分线性关系考察结果

成分回归方程R2线性范围/μg 芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷Y＝26 119X－0.139 90.999 50.006 5～1.30 大黄酸-8-O-葡萄糖苷Y＝7632.7X＋33.5670.999 50.012 1～2.42 大黄素-1-O-葡萄糖苷Y＝16 526X－2.911 60.999 90.014 0～0.56 大黄酚-8-O-葡萄糖苷Y＝9244.8X＋20.5750.999 60.010 6～2.12 大黄素-8-O-葡萄糖苷Y＝16 374X＋34.2150.999 80.021 2～4.24 大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷Y＝2784X＋20.5920.999 60.010 2～2.04 芦荟大黄素Y＝21 300X＋63.8930.999 70.023 3～4.66 大黄酸Y＝6023.9X＋72.890.999 60.053 0～4.24 大黄素Y＝25 950X－5.045 90.999 50.017 5～3.50 大黄酚Y＝12 304X＋167.950.999 60.039 6～7.92 大黄素甲醚Y＝2158.5X＋32.8110.999 60.041 5～3.33

2.1.5 精密度试验

分别精密吸取混合对照品溶液各10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件，连续进样6次，分别记录各成分的峰面积积分值，计算RSD为0.46%～2.33%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验

取同一大黄供试品溶液，于4 ℃放置保存，按“2.1.1”项下色谱条件，分别于0、4、8、12、20、24 h进样检测并记录峰面积，计算RSD为1.32%～2.89%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.7 重复性试验

精密称取同一大黄样品1.0 g，共6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定，并记录各成分峰面积，计算RSD为1.09%～2.89%，表明本法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验

取同一批已测定的大黄样品粉末约0.5 g，精密称定，置于250 mL具塞三角瓶中，分别加入相同质量的对照品，最后加入甲醇溶液25 mL，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，测定各成分的色谱峰面积，计算含量和回收率。结果显示，11种蒽醌类成分的平均回收率为95.07%～102.35%，RSD为2.69%～3.48%，表明本方法的准确性较好。

2.1.9 样品含量测定

精密称取大黄样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，测得各成分峰面积积分值，代入线性回归方程，以外标法计算样品中各成分的含量。

2.2 产地加工炮制一体化工艺优选

2.2.1 Box-Behnken试验设计与结果

在预试验基础上，以含水量（A）、切制规格（B）、干燥温度（C）为考察因素，采用Design Expert 8.0软件设计三因素三水平Box-Behnken试验方案。以大黄芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷（X1）、大黄酸- 8-O-葡萄糖苷（X2）、大黄素-1-O-葡萄糖苷（X3）、大黄酚-8-O-葡萄糖苷（X4）、大黄素-8-O-葡萄糖苷（X5）、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷（X6）、芦荟大黄素（X7）、大黄酸（X8）、大黄素（X9）、大黄酚（X10）、大黄素甲醚（X11）的综合评分为因变量，采用加权评分法优选大黄产地加工炮制一体化工艺。以含量最大值为100分，按其他含量值占最大值的比例划分，由于其药效贡献值大小未知，故设定权重系数均为1/11，计算综合评分（Y）。Y＝（X1/max1＋X2/max2＋……X11/max11）×100/11[8-9]。试验因素水平见表2，试验方案与结果见表3。

表2 Box-Behnken试验设计因素与水平

水平含水量/%切制规格/mm干燥温度/℃ ABC -1302.055 0352.560 1403.065

2.2.2 模型建立与分析

将各组综合评分数据采用Design Expert 8.0软件进行多元回归和二项式分析，建立综合评分对3个因素的二次回归模型方程：＝96.06－4.35－0.15－5.27－3.96－2.72＋2.59－15.72－6.692－7.082。对回归模型进行方差分析，结果见表4。模型＝56.20，＜0.01，表明该模型在本试验范围内有统计学意义，该回归模型与试验数据拟合程度高，可用于优选大黄产地加工炮制一体化工艺。因素A、C、AB、A2、B2、C2对响应值的影响极显著（＜0.01），因素AC、BC对响应值的影响显著（＜0.05），因此各因素对响应值的影响不是简单的线性关系，所选因素之间存在显著的交互作用。利用Design Expert 8.0软件进行拟合，直观了解各因素之间两两交互作用对加工工艺的影响，见图2。

表3 Box-Behnken试验设计方案与结果

试验号ABC指标成分含量/（mg/g）Y X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11 11010.622 81.527 61.040 61.921 31.024 31.613 11.099 8 7.874 31.296 4 8.853 5 9.969 360.74 20000.758 13.115 41.932 02.820 71.703 92.638 22.519 313.918 62.079 410.543 212.949 196.06 30000.758 13.115 41.932 02.820 71.703 92.638 22.519 313.918 62.079 410.543 212.949 196.06 410-10.740 21.310 51.065 02.317 02.072 52.436 92.058 3 7.657 91.896 9 9.300 3 9.696 976.08 50000.758 13.115 41.932 02.820 71.703 92.638 22.519 313.918 62.079 410.543 212.949 196.06 6-1-100.702 71.986 11.556 41.477 31.388 12.159 52.077 110.705 31.747 3 8.892 711.183 075.49 7-10-10.636 82.166 41.565 02.335 81.156 22.916 71.899 810.974 21.393 311.595 112.254 180.29 81-100.754 72.067 11.695 21.611 61.786 62.718 72.077 8 7.986 91.557 8 7.715 5 8.762 775.66 90-1-10.797 12.540 71.328 32.646 51.916 42.382 32.321 110.667 01.955 511.483 112.806 388.81 10-1100.716 61.924 01.620 22.433 91.913 31.641 12.016 010.224 31.870 2 8.970 811.035 579.50 110-110.685 92.867 31.529 51.461 01.074 91.370 81.649 811.443 61.390 410.533 711.074 572.45 120000.758 13.115 41.932 02.820 71.703 92.638 22.519 313.918 62.079 410.543 212.949 196.06 13-1010.664 51.987 81.595 81.469 21.989 71.800 32.252 710.297 81.499 1 8.591 111.214 675.82 141100.692 41.421 60.980 21.900 71.150 41.998 11.575 7 7.481 21.383 6 8.810 0 9.150 963.84 150000.758 13.115 41.932 02.820 71.703 92.638 22.519 313.918 62.079 410.543 212.949 196.06 1601-10.815 42.246 61.519 32.460 02.069 42.438 81.853 810.794 91.876 211.508 212.174 286.93 170110.562 42.530 91.680 72.350 31.351 31.740 22.201 913.203 61.783 010.140 011.590 980.95

表4 回归模型方差分析结果

来源平方和自由度均方F值P值模型2069.05 9229.8956.20＜0.000 1 A151.21 1151.2136.970.000 5 B0.18 10.180.0430.841 1 C222.08 1222.0854.290.000 2 AB62.65 162.6515.320.005 8 AC29.54 129.547.220.031 2 BC26.94 126.946.590.037 2 A21043.81 11043.81255.18＜0.000 1 B2188.59 1188.5946.100.000 3 C2211.21 1211.2151.630.000 2 残差28.63 74.09 失拟项28.63 39.54 误差0 40 总离差2097.6816

2.2.3 最佳工艺条件预测与验证

根据Design Expert 8.0软件分析计算，大黄加工的最佳工艺为：含水量34.50%，切制规格2.47 mm，干燥温度58.19 ℃，理论得分为97.24。为方便试验操作，将最佳工艺修正为：含水量35%，切制规格2.5 mm，干燥温度60 ℃。采用上述工艺参数，进行3次平行试验，结果综合评分为96.18，与理论预测值的偏差为1.08%，具有良好的吻合度。

图2 含水量、切制规格和干燥温度对综合评分的交互作用响应面图

3 讨论

蒽醌类成分是大黄的重要活性成分，具有多种生物活性和药理作用。鉴于2015年版《中华人民共和国药典》以总蒽醌和游离蒽醌作为指标评价大黄饮片质量，本研究以芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷等11种成分为指标，可全面、综合地评价大黄质量，优选大黄的产地加工炮制一体化工艺。

大黄为临床常用药，广泛用于内、外、妇、儿、骨伤科等多种疾病，其产地初加工问题不容忽视。本试验应用现代科学技术将大黄产地加工与炮制有机结合，有效解决了由于大黄药材根部粗大而难以干燥的问题，最大程度减少因2次干燥、2次浸润导致有效成分流失的问题，减少药材中间贮藏和加工环节，降低人力物力和生产成本。与传统熏干方法比较，可节约能源，减少污染，达到绿色经济生产的目的。本研究优选的大黄产地加工炮制一体化工艺简单、可靠，可为中药饮片生产提供新的思路。

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Study on Integrative Technology of Primary Processing for Rhei Radix et Rhizoma Based on Response Surface Methodology

XIN Erdan1,2, SI Xinlei1,2, BIAN Tiantian1,2, NIU Jiangtao1,2, ZHANG Yugui1,2,ZHANG Shujuan1,2, LI Yuefeng1,2

To optimize the integrative technology of primary processing for Rhei Radix et Rhizoma by response surface methodology.Taking the comprehensive scores of 11 kinds of chemical components such as aloe-emodin-8-O-glucoside in Rhei Radix et Rhizoma as the indexes of investigation, and taking the water content, cutting specifications and drying temperature as the factors of investigation, Box-Behnken design was used to optimize the integrative technology of primary processing for Rhei Radix et Rhizoma.Optimum integrative technology of primary processing was as follows: water content 35%, cutting size 2.5 mm, drying temperature 60 ℃.The optimized integrative technology of primary processing of Rhei Radix et Rhizoma is easy and feasible, with high accuracy, which can be used for integrative technology of primary processing of Rhei Radix et Rhizoma.

response surface methodology; Rhei Radix et Rhizoma; integrative technology of primary processing; HPLC