血清甘氨酸水平与冠心病的关系研究

栗向辉 刘君萌 牟洪娜 李红霞 王思明 唐月明 王玉 何青 陈文祥 董军 杨睿悦

100730北京大学第五临床医学院(栗向辉、唐月明、王玉)；100730北京医院 国家老年医学中心，卫健委老年医学重点实验室(栗向辉、牟洪娜、李红霞、王思明、唐月明、王玉、陈文祥、董军、杨睿悦)，心内科(刘君萌、何青)，卫健委临床检验中心(陈文祥)

冠心病(coronary artery disease ，CAD)病因复杂，严重危害人类健康，已经成为全球许多国家的首要死亡原因。早期鉴别、诊断并且及时干预CAD的危险因素是降低其发病率和死亡率的重要手段[1]。对CAD的传统危险因素如高血压、血脂异常、糖尿病等的干预已取得明显成效，但相当一部分患者上述危险因素已控制而CAD发病风险依然存在。因此，寻找和研究新的危险因素对预防或延缓CAD发生与发展具有重要意义。

近期一些代谢组学研究发现血清甘氨酸(glycine，Gly)水平与传统的心血管病危险因素，如血压、三酰甘油、血糖和体质指数(body mass index， BMI)等都呈明显的负相关关系[2-4]。除此之外，肥胖和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者血清的Gly水平明显低于正常人群，并且改善胰岛素抵抗状态能够增加血清Gly水平[5-7]。然而目前尚缺乏血清Gly水平与CAD之间的关系研究，因此本研究利用同位素稀释液相色谱串联质谱法测定行冠状动脉造影诊断为CAD患者及健康对照组人群血清的Gly浓度，分析血清Gly水平与CAD及其危险因素的关系。

1 对象和方法

1.1 研究对象

本研究为病例对照研究，选取2008—2011年间在北京医院接受冠状动脉造影并确诊为CAD的住院患者143例(102例男性和41例女性，30～84岁)。CAD的定义为冠状动脉造影结果显示左前降支、左回旋支、右冠状动脉以及主要分支中至少有一只血管狭窄程度≥50%[8]。具有以下特征的患者被排除在研究之外：在前2个月内不稳定性心绞痛和心肌梗死，或在前6个月接受降脂治疗。从2011年8～10月在北京医院参加体检的表观健康人中随机选取健康对照组(286名)，与CAD患者按年龄(±3岁)和性别进行2∶1比例匹配，具体信息参见以前发表的文章[9]。对照组排除心绞痛史、既往行冠状动脉造影史，心肌梗死或其他已知的心血管疾病史、脑血管病、恶性肿瘤、血液系统疾病、慢性阻塞性肺疾病、自身免疫系统疾病、感染性疾病等，且肝肾功能正常、无应激情况。使用标准化问卷记录入选者健康状况、年龄、性别、吸烟和疾病史等信息。测量身高、体重和坐位血压。采集清晨空腹静脉血标本，分离血清并储存于-80℃冰箱。本研究经北京医院伦理委员会审核批准。所有参与者均签署知情同意书。

1.2 方法

血清Gly浓度采用本实验室前期建立的同位素稀释液相色谱串联质谱法测定[10]。分别取0.05 ml标准系列溶液(标准品购自美国Sigma-Aldrich公司)和血清样品与0.05 ml同位素标记的内标(稳定同位素内标Gly-D5购自美国Cambridge公司)溶液混合。加入含有0.1%甲酸的乙腈0.4 ml，振荡离心，吸取上清液置入进样瓶中，室温下氮气吹干，加入0.2 ml 0.1%甲酸水溶液复溶，液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)进行分析。采用1200型高效液相色谱仪(美国 Agilent公司)，色谱柱为Waters Shield C18柱(3.5 μm，2.1×150 mm)，流动相为含0.01%甲酸的水-乙腈(90∶10)溶液，流速0.3 ml/min。质谱仪为API 4000 Triple Quadruple质谱仪(美国AB SCIEX公司)，采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，气帘气、雾化气和碰撞气分别为50、60和70 psi。喷雾电压为5 500 V，去溶剂温度700℃。Gly和内标的离子跃迁分别为m/z 76.0→30.0和78.0→32.0。以标准溶液Gly浓度为X轴，Gly和内标Gly-D5峰面积的比值为Y轴，进行线性回归分析。

血清样本的常规生化指标，如空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等使用来自日本第一化学试剂的测定试剂盒，在Hitachi 7600全自动生化学分析仪上检测。计算血浆致动脉粥样硬化指数(atherosclerosis index of plasma，AIP)，AIP=lg[TG/HDL-C]。血脂异常包括高TG血症、高TC血症、高LDL-C血症以及低HDL-C血症，分别定义为TG>1.70 mmol/L，TC>6.21 mmol/L，LDL-C>4.14 mmol/L以及HDL-C<1.04 mmol/L[11]。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 人群的基本资料

429名参与者的血清Gly浓度呈偏态分布(峰度4.40，偏度1.52)，经过转换后仍未达到正态分布。由表1所示，根据Gly的三分位数分布，血清Gly水平较低者，年龄较大(P趋势=0.001)，并且吸烟史、高血压史、高TG和低HDL-C血症的比例偏高(均为P趋势<0.05)。随着Gly水平的逐渐增加，CAD患者的比例显著降低(P趋势<0.001)。就代谢特征而言，随着Gly水平的增加，BMI、SBP、AIP和TG的水平逐渐降低(均为P趋势<0.01)；HDL-C的水平逐渐增加(P趋势<0.001)。CAD患者的血清Gly水平[219.1 (195.6，262.0) μmol/L] 显著低于对照组 [269.0 (240.0，308.6) μmol/L](P<0.05)。与对照组相比，CAD组患者具有更高的吸烟史、患T2DM、高TG血症以及低HDL-C血症的比例。CAD组和健康对照组的基线资料的对比详见课题组之前发表过的文章[9]。

表1 人群的基线资料

注：CAD：冠心病；BMI：体质指数；SBP：收缩压；DBP：舒张压；T2DM：2型糖尿病；Gly：甘氨酸；TC：总胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；AIP：血浆致动脉粥样硬化指数；TG：三酰甘油；FBG：空腹血糖

2.2 血清Gly水平与传统CAD危险因素的偏相关分析

在校正年龄和性别后，血清Gly水平与CAD的一些传统危险因素，如BMI、SBP、TG、AIP呈显著负相关(均为P<0.05)；与HDL-C呈显著正相关(P<0.001)。与DBP、TC、LDL-C以及FBG无明显相关性(均为P>0.05)，见表2。

表2 血清Gly水平与CAD传统危险因素的偏相关分析

注：BMI：体质指数；SBP：收缩压；DBP：舒张压；TC：总胆固醇；TG：三酰甘油；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；AIP：血浆致动脉粥样硬化指数；FBG：空腹血糖

2.3 血清Gly水平与CAD之间的logistic回归分析

在模型1中，单因素logistic回归结果显示，血清Gly水平降低可能是CAD的危险因素(OR=0.29，95%CI：0.19～0.40，P<0.001)。

多因素logistic回归分析时，在校正年龄、性别、高血压、T2DM、血脂异常等CAD的传统危险因素以后，血清Gly水平每增加1个标准差，CAD的发生风险降低68%(OR=0.32，95%CI：0.21～0.47，P<0.001)，见表3。

3 讨论

据《中国心血管病报告2017》报道，我国心血管疾病患病率和死亡率仍处于持续上升阶段，其中CAD患者数量高居前三[12]。代谢物作为细胞调节过程的终极产物，其水平可以反映体内外环境改变对生物系统的影响。最近通过代谢组学研究发现一系列小分子代谢物与心血管代谢性疾病发生发展密切相关，为临床CAD危险预测、诊断、预后和疗效评估，以及进一步阐明疾病发病机制提供了重要手段。

Gly是人和动物体内结构最简单的非必需氨基酸，主要在肝脏和肾脏中合成，用于生成肌酸、嘌呤、葡萄糖和胶原蛋白等，参与抗炎抗氧化反应以及免疫功能调节等生理过程[13]。近期代谢组学研究发现，与健康人群相比，肥胖、T2DM和代谢综合征患者血清Gly水平显著降低[6-7， 10]。在活动受限的超重老年人中，血清Gly水平与稳态评估模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)显著负相关；并且血清Gly与脂肪分布相关，与反映较好胰岛素敏感性的大腿皮下脂肪量显著正相关，而与反映较差胰岛素敏感性的大腿肌间脂肪和腹部脂肪量显著负相关[14]。前瞻性研究中也证实，血清Gly水平降低能够预测T2DM、血脂异常和代谢综合征的发生[15]。然而，目前国内外研究多集中于血清Gly水平与心血管病危险因素及糖尿病等代谢性疾病的关联性研究，与CAD及心血管事件的关系尚缺乏研究。

本研究通过同位素稀释液相色谱串联质谱法测定CAD患者和健康对照组血清的Gly浓度，结果显示CAD患者体内血清Gly水平显著低于健康人。多因素logistic回归进一步证实，血清Gly水平降低与CAD发生危险增加独立相关，此关系不受糖尿病、高血压以及血脂紊乱等因素的影响。

表3 血清Gly水平与CAD的logistic回归分析

注：a模型1：单因素logistic回归；b模型2：模型1基础上调整年龄和性别；c模型3：模型2基础上进一步调整高血压和糖尿病；d模型4：模型3基础上进一步调整高TG血脂、高TC血脂、高LDL-C血症以及低HDL-C血症

Gly作为潜在的代谢性疾病保护因素的机制可能与其抗氧化能力有关，Gly是机体内源性抗氧化物谷胱甘肽(GSH)的重要组成成分，老年人膳食补充Gly可使GSH保持活力并且增强胰岛素敏感性。口服Gly能够有效降低T2DM患者体内的氧化应激状态和炎症损伤[16-17]。Gly还能够直接或间接刺激肠道激素的分泌，进而增强胰岛素敏感性，促进循环中葡萄糖的清除，抑制胰高血糖素生成内源性葡萄糖[18]。Gly参与心血管病的机制还需要进一步研究。

由于血清Gly暴露水平测量与受试者招募同时进行，因此无法确定关联的时间顺序，以及血清Gly水平变化与CAD的因果关系。这些结果还需要在未来的前瞻性研究中进一步证实。此外，本研究未对入选的健康对照组进行冠脉造影，以对确诊冠心病患者予以排除，这样可能造成偏倚，这也是本研究的局限性之一。

综上所述，我们的研究发现血清Gly降低与CAD发生危险增加独立相关，有望在CAD的危险评估中发挥作用。

利益冲突：无