胃癌组织中Septin9 和Cyclin D1 的表达及临床意义

江威，章礼久

（安徽医科大学第二附属医院，安徽 合肥）

0 引言

胃癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，我国是胃癌的高发国家之一，据2015 年中国癌症数据报告显示，胃癌发病率和死亡率在恶性肿瘤中均高居第二位[1]，严重危害了人民群众的健康。研究表明，进展期胃癌患者即使接受外科手术等综合治疗，5 年生存率仍不足30%[2]。因此，积极探索胃癌的发病机制，寻求新的生物标记物和治疗靶点对于胃癌的诊治和预后具有重要的临床意义。SEPT 基因家族是一类具有GTPase 活性的保守基因家族，广泛分布在除植物外的几乎所有真核生物中。参与细胞极性、细胞分裂、细胞周期调控及凋亡等重要生理过程，并与肿瘤的发生发展直接相关[3]。研究表明Septin9 在结直肠癌[4,5]、血液系统肿瘤[6]、乳腺癌[7]等多种肿瘤中高表达，其高表达可促进细胞增殖，增强细胞侵袭能力。细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是G1 期的关键调控蛋白，驱动细胞由G 期进入S 期。Cyclin D1 已被公认是一种原癌基因，其过表达可引起细胞增殖失控，最终导致肿瘤发生[8]。以上提示，Septin9 和Cyclin D1 均在肿瘤细胞周期调控以及发生发展中发挥重要的作用。本研究通过检测Septin9 和Cyclin D1 在胃癌组织中的表达情况，初步探讨其临床意义，旨在为胃癌的生物学行为提供新的参考指标，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018 年2 月至2019 年6 月在安徽医科大学第二附属医院行手术切除的胃癌标本60 例。均经过术后病理证实，病理诊断均经两名医师确认，患者具备完整的临床及病理学资料。其中男性41 例，女性19 例；年龄35～79 岁，平均年龄62.7±9.5 岁。肿瘤直径≤5 cm 18 例，＞5 cm 42 例。肿瘤位于贲门/胃底26 例，胃体15 例，胃窦19 例。术后病理均为腺癌，其中低分化37 例，中分化14 例，高分化9 例；根据TNM 分期，其中TNM I 期7 例，TNM II 期14 例，TNM III 期18 例，TNM IV 期21 例；浸润深度：T1 期 7 例，T2 期10 例，T3 期16 例，T4 期27 例；有淋巴结转移者36 例，未发生转移者24 例。另外，选取对应的60 例距离肿瘤组织边缘＞5cm 的癌旁正常组织作为对照组。所有患者在术前均未接受化疗、放疗或其他辅助治疗。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂

兔抗Septin9 多克隆抗体购自Affinity 公司；兔抗Cyclin D1多克隆抗体购自Affinity 公司；鼠抗β-actin 抗体购自北京中杉金桥有限公司；山羊抗小鼠IgG 购自北京中杉金桥有限公司；山羊抗兔IgG 购自Affinity 公司。

1.2.2 Western blot 实验

新鲜胃癌和癌旁组织，剪碎，加入蛋白裂解液，进行研磨，4℃，13200rpm 离心20 分钟，提取总蛋白。根据BCA 试剂盒的步骤绘制蛋白定量标准曲线，计算样品的浓度值。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到PVDF 膜上。5% 脱脂奶粉封闭，一抗4℃冰箱过夜，TBST 洗膜，10 min/ 次，共3 次，二抗室温孵育60min，洗膜3 次后滴加ECL 发光液，曝光显影，观察结果。采用Image J 软件分析不同条带的灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参条带灰度值。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0 统计学软件对实验数据统计分析。定量资料数据以均数±标准差（±s）表示，两组间均数采用t 检验比较，采用Pearson 相关性分析法分析相关性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Septin9 与Cyclin D1 在胃癌组织及癌旁组织中的表达情况

60 例胃癌组织中Septin9 蛋白的相对表达量为（0.754±0.179），高于对应的癌旁组织表达水平 (0.101±0.020)，两者差异有统计学意义（P＜0.05）（见图1）。不同临床分期的胃癌组织中，Septin9 蛋白表达随着临床分期增加而递增，差异具有显著统计学 意义（P＜0.01）（见图2）。Cyclin D1 在胃癌组织 中的相对表达量为（1.217±0.245），高于对应的癌旁组织表达水平（0.132±0.038），差异具有统计学意义（P＜0.05）（见图3）。不同临床分期的胃癌组织中，Cyclin D1 蛋白表达亦随临床分期增加而递增，差异具有统计学意义（P＜0.05）（见图4）。

图2 Septin9 在不同临床分期中的表达情况。(A) western blot 法检测 Septin9 在不同临床分期胃癌组织中的表达情况。（B）Septin9 蛋白表达的Image J 灰度分析结果。＊＊P＜0.01 与I 期比较，##P＜0.01 与II 期比较。

图3 Cyclin D1 在胃癌组织中的表达。（A）western blot 法检测Cyclin D1 在胃癌和癌旁组织中的表达情况。（B）Cyclin D1 蛋白表达的Image J 灰度分析结果,＊＊P＜0.01 与癌旁比较。

图4 Cyclin D1 在不同临床分期中的表达情况。(A) western blot 法检测Cyclin D1 在不同临床分期胃癌组织中的表达情况；（B）Cyclin D1蛋白表达的Image J 灰度分析结果。＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 与I 期比较，##P＜0.01 与II 期比较，△△P＜0.01 与III 期比较。

2.2 胃癌组织中Septin9、Cyclin D1 表达分别与临床病理参数的关系

Septin9 表达与性别、年龄、肿瘤大小、发生部位无明显相关性(P＞0.05)，与胃癌分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移、TNM分期密切相关（P＜0.05）。Cyclin D1 表达与性别、年龄、肿瘤大小、发生部位、浸润深度无明显相关性(P＞0.05)，与胃癌分化程度、有无淋巴结转移和TNM 分期密切相关（P＜0.05），详见表1。

2.3 胃癌组织中Septin9 和Cyclin D1 表达的相关性

在胃癌组织中，Septin9 和Cyclin D1 表达呈正相关，具有统计学意义（P＜0.01），见图5。

3 讨论

肿瘤的发生是一个极其复杂的过程，受多种癌基因、抑癌基因和环境因素的调控。其基本的生物学特征是肿瘤细胞的失控性增殖和凋亡的减少。精确的细胞分裂对于多细胞的发育至关重要，细胞周期紊乱、细胞增殖失控促进了肿瘤的发生、发展[9]。故探讨与恶性肿瘤细胞周期调控有关的基因或蛋白，对于肿瘤的诊治和预后具有重要意义。

表1 Septin9、Cyclin D1 表达与胃癌临床病理特征的关系

图5 散点图示在胃癌组织中Septin9 和Cyclin D1 的表达具有相关性，P＜0.01。

SEPT9 是SEPT 基因家族中的一员，位于人类染色体 17q25.3，有18 种转录产物[10]。基因芯片分析表明SEPT9 在多种人类肿瘤中持续表达[11]，包括乳腺、中枢神经系统、肾脏、肝脏和卵巢等。Connolly D 等[12]发现，SEPT9 基因的4 个变异型v1、v3、v6 和v7 在乳腺癌组织中均高表达。Montagna 等[13]在SEPT9过表达的乳腺癌细胞系中发现了Thsp1 和Bax 介导的细胞凋亡下调，并可以通过抑制SEPT9 的表达来逆转这种效应。本研究结果显示，Septin9 在胃癌组织中高表达，与癌旁组织比较具有统计学意义，与李楠[14]报道的结果一致。进一步分析发现，Septin9 的表达随着临床分期的增加而递增，且与胃癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM 分期均有关，表明Septin9 的表达与胃癌发生发展密切相关。

细胞周期蛋白D1(Cyclin D1) 基因是一种重要的原癌基因。CyclinD1 编码的蛋白与细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）或CDK6 结合，触发视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）的磷酸化，驱动细胞由G1 期进入S 期。Cyclin D1 过表达可引起细胞增殖失控，促进肿瘤的发生[8]。Cyclin D1 基因在大部分人类肿瘤中如胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈部鳞癌和结直肠癌等过表达或扩增[15]。本研究显示，Cyclin D1 在胃癌组织中高表达，且相对表达量高于癌旁组织，与在其他肿瘤中的结果一致，并且Cyclin D1 的表达随临床分期增加而递增，与胃癌分化程度、淋巴结转移和TNM 分期密切相关。此外，本研究相关性分析显示，胃癌中SEPT9 过表达与Cyclin D1 高表达呈正相关。提示Cyclin D1 高表达可能参与了SEPT9 介导的胃癌进展的过程。Gonzalez 等[16]发现，乳腺癌细胞中SEPT9_v1 表达上调,通过延迟c-Jun-N-末端激酶(JNK)的降解，稳定JNK1、JNK2 激酶的表达水平，从而增加JNK / c-Jun转录活性，引起下游的Cyclin D1 表达上调，促进细胞增殖。与本研究结果相一致。

综上所述，Septin9 和Cyclin D1 在胃癌组织中高表达，两者均与胃癌分化程度、淋巴结转移和TNM 分期有关，且Septin9 与Cyclin D1 蛋白表达呈正相关，提示两者可能在胃癌的发生发展中起重要作用。进一步的研究分析对于胃癌的诊断和治疗具有一定的临床意义。