820 nm光吸收曲线技术在逆境条件下叶片光系统Ⅰ性能研究中的应用

王仁杰，蒋 燚，朱 凡，唐 正，刘雄盛，姜 英，王 勇

（1.广西壮族自治区林业科学研究院，广西南宁 530002；2.中南林业科技大学生命科学与技术学院，湖南长沙 410004）

光合作用对植物的生长发育具有重要意义，植物的光合作用包括光反应和暗反应2个阶段，高等植物的光反应由光系统Ⅱ（PSⅡ）、细胞色素b6f复合物（Cyt b6f）、光系统Ⅰ（PSⅠ）以及ATP合成酶复合物共同参与，通过光合电子传递及光合磷酸化等过程完成电子从H2O到NADP+的传递并产生ATP、释放O2[1]。其中，PSⅠ复合物在光合电子传递链的还原端作为质体蓝素-铁氧还蛋白氧化还原酶起作用。PSⅠ除了参与线性传递，还参与围绕PSⅠ的循环电子传递和水循环[2]等。早期研究认为PSⅡ是逆境条件下光合机构中最敏感的组分，而PSⅠ较稳定[3]。直到1994年，在研究低温胁迫对高等植物光系统的抑制作用时首次发现黄瓜（Cucumis sativus）叶片中PSⅠ的光抑制现象，且在该胁迫下，光抑制的主要位点是PSⅠ而非PSⅡ[4]，现已证明这一现象在高等植物中普遍存在[5-6]。当PSⅠ发生光抑制后其活性往往需要经过长时间才能恢复，因此，PSⅠ活性的缓慢恢复最终导致PSⅠ成为限制光合作用的重要因素[7]。近年来，随着PSⅠ活体测定技术的发展，对PSⅠ光抑制和光破坏防御机制的研究更加深入[8-10]。本文介绍了利用820 nm光吸收曲线技术测定PSⅠ的光化学效率、环式电子传递能力和能量分配的基本原理及其应用研究进展，以期为820 nm光吸收曲线技术在其它条件下对PSⅠ性能影响提供理论和技术支撑。

1 820 nm光吸收曲线技术

820 nm光吸收曲线能对叶片进行快速和无损伤测定，因此被广泛应用于PSⅠ原初光化学反应检测[11]。测定时，先将植物叶片进行完全的暗适应，使PSⅠ反应中心（P700）及其原初电子供体质蓝素（PC）均处于还原态，然后对植物叶片进行照光处理，PSⅠ开始进行原初光化学反应，P700和PC失去电子，分别变为氧化态的P+700和PC+，两者均能吸收820 nm波长的光[12]。此时820 nm光吸收曲线处于下降阶段，若有电子到达PSⅠ反应中心，P+700和PC+则被重新还原为P700和PC，此时820 nm光吸收曲线处于上升阶段。除了P+700和PC+能吸收820 nm波长的光，植物的其它组织也能吸收820 nm波长的光，如植物叶片组织结构的变化也会影响P+700和PC+对820 nm光的吸收作用。因此，研究中820 nm光吸收曲线多用MR/MR0表示，以排除其它因素对820 nm光吸收的影响，其中MR0为开始照光时的初始荧光值，MR为任意时刻的荧光值。此时，MR/MR0比值的变化还能反映P700和PC的氧化还原状态的变化[13]，820 nm光吸收曲线常使用多功能植物效率分析仪（M-PEA,Hansatech,UK）进行测定，根据暗适应和光照强度及时间等参数设定的不同，820 nm光吸收曲线呈现不同的形态，可以从不同角度反应PSⅠ内部的变化。

2 PSⅠ实际光化学效率的测定原理及应用

图1 红光照射下的820 nm光吸收曲线Fig.1 Light absorbance at 820 nm under illumination of red light

红光照射条件下同时激发PSⅡ与PSⅠ，该条件下测定的PSⅠ活性，包括了PSⅡ的作用。因此，红光条件下，测定PSⅠ的活性更有实际意义[14]。完全暗适应的植物叶片组织照射红光后，P+700和PC+的比例增加，820 nm光吸收增加，820 nm光信号检测值降低。当来自PSⅡ的电子到达P+700和PC+后，二者均被还原，820 nm光吸收减少，820 nm光信号检测值降低变缓。当P700和PC的氧化还原速率相同时，820 nm光信号检测值停止下降，随着照光时间的增加，当P+700和PC+的还原速率超过P700和PC的氧化速率时，820 nm光信号检测值开始上升[15]。Strasser等[13]利用MR/MR0快速下降阶段的振幅（ΔIR/I0）研究PSⅠ的实际光化学效率，即自然条件下PSⅠ的活性，该方法侧重于反映PSⅠ整体性能，多数研究用该参数直接衡量PSⅠ的真实活性，研究表明巴尔干苣苔（Haberlea rhodopensis）在干旱胁迫前期，820 nm光吸收曲线下降幅度增大，上升幅度减少，干旱胁迫后期，820 nm的光吸收曲线下降幅度减小，上升幅度基本为零，表明干旱前期PSⅠ活性的变化是由PSⅡ到达PSⅠ的电子逐渐减少导致的，后期则是由PSⅠ自身受损导致的；也有研究用820 nm光吸收曲线的最大下降速率（VPSⅠ）和最大上升速率（VPSⅡ-PSⅠ）来反映PSⅠ自身氧化还原的速率和PSⅡ到PSⅠ电子传递速率的变化，进而计算PSⅡ的电子传递速率（VPSⅡ）[16]。通过测定红光激发下的820 nm光吸收曲线并运用该方法计算相关参数，结果表明，干旱胁迫下平邑甜茶（Malus hupehensis）叶片经过硅处理后，VPSⅠ和VPSⅡ-PSⅠ均显著大于对照，该研究结果说明平邑甜茶根部施硅肥可以提高PSⅠ复合体的活性，促进PSⅡ到PSⅠ之间光合电子传递的过程，从而提高叶片的光化学效率，避免过剩光能产生活性氧伤害叶片的光合机构[17]。

3 PSⅠ最大光化学效率的测定原理及应用

自然条件下不存在单独远红光激发产生的光化学反应，只有通过仪器激发才能单独使PSⅠ发生光化学反应，远红光下测定的指标更能体现PSⅠ绝对真实的状态。在完全暗适应的植物绿色组织照射远红光后，P+700和PC+的比例增加，对820 nm光吸收增加，反射减少，检测到的820 nm光信号降低。远红光激发下，只有PSⅠ发生光化学反应，PSⅡ中未发生光化学反应，即PSⅡ反应中心无电子到达P+700和PC+，820 nm光吸收持续增加，直至P700和PC几近完全氧化为P+700和PC+，820 nm光信号降低至最低点，远红光下测定820 nm光吸收的相对振幅（ΔIF/Io）作为衡量PSⅠ最大光化学效率的指标[18]。Bukhov等[19]在4℃的低温环境下暗适应30 min后，用300 μmol·m-2·s-1光强测定黄瓜叶片内部PSⅠ的活性，研究表明，光抑制下敌草隆或甲基紫精有助于电子从质体醌（PQ）向P700传递，且影响P+700再还原过程的主要因素为光照强度太低，而不是低温胁迫。李耕 等[20]利 用 PEA-Senior（Hansatech，UK）将 玉 米（Zea mays）叶片暗适应15 min，然后照射10 s的远红光进行激发，测定820 nm光吸收曲线，计算PSⅠ最大光化学效率，反映Cd胁迫下玉米叶片PSⅠ的客观性能；结合PSⅡ和羧化反应的变化，表明Cd胁迫造成玉米叶片光合作用过程中光能-电能-化学能的转化受阻，光合还原力NADPH积累，PSⅠ电子积累量过剩，最终导致其性能下降；暗反应中羧化效率的降低也阻碍了光系统中电子的传递，造成电子在PSⅠ内大量积累，玉米叶片光系统中PSⅠ性能下降的速率快于PSⅡ，最终导致2个光系统间的协调性下降。

4 PSⅠ环式电子传递能力的测定原理及应用

围绕PSⅠ的环式电子传递是维持光合作用高效进行的保护机制[21]。PSⅠ受损主要源于超氧阴离子在PSⅠ受体侧的积累，引起PSⅠ反应中心铁硫蛋白的过度还原[22]。而围绕PSⅠ的环式电子流可以将PSⅠ处过多的电子传递给其他的电子载体，减少PSⅠ压力，起到保护PSⅠ的作用[23]。当经过充分的暗适应后，用远红光照射时，最初电子从PSⅠ到达NADP＋，但经过长时间的远红光激发后，PSⅠ内部电子过剩时，PSⅠ内产生的环式电子链将电子从NADP＋重新传递到P700和PC，使 P+700和 PC+再次还原，以免PSⅠ内部由于过氧化而遭到损伤。此时，远红光激发下，820 nm光吸收曲线快速上升的过程反映了PSⅠ环式电子传递能力的大小。利用该原理，杨程[24]在研究草酸根离子处理对烟草（Nicotiana tabacum）叶片环式电子传递的影响时，先将烟草叶片进行充分暗适应，照射20 s的远红光后，关闭光源，得到一条快速上升的820 nm光吸收曲线，其上升速率用来反映环式电子传递的活性，研究表明K2C2O4处理烟草叶片后，820 nm光吸收曲线上升速率显著低于KCl处理和对照叶片，这表明K2C2O4对烟草叶片环式电子传递具有显著的抑制作用，环式电子传递能力的下降表明光合驱动力下降，光保护机制受到破坏。

5 PSⅠ内部能量分配的测定原理及应用

研究表明PSⅠ吸收光能的途径为主要耗散途径，包括光化学淬灭引起的能量耗散（Y（Ⅰ））、PSⅠ供体侧限制引起的能量耗散（Y（ND））以及PSⅠ受体侧限制引起的能量耗散（Y（NA）），3者之和等于1[25]。通过能量比例的分配可以了解PSⅠ对光能的利用和耗损以及PSⅠ内部是否受到光损伤。Se⁃jima等[26]用2 000 μmol·m-2·s-1的短脉冲光（300 ms），每10 s的频率照射低氧状态下的向日葵（Helianthus annuus）叶片，结果表明叶片Y（Ⅰ）降低，Y（NA）升高，Y（ND）在照射期间基本没有变化，说明低氧状态下首先限制PSⅠ供体侧的性能。在此研究的基础上，梁英等[27]利用M-PEA植物效率仪（Hansatech，UK）测定820 nm光吸收曲线，系统地研究在持续光处理和频闪光处理下小麦（Triticum aestivum）叶片PSⅠ内部不同的能量分配方式，研究表明持续光处理下小麦叶片中PSⅠ的能量分配基本没有发生变化，而频闪光处理下小麦叶片中PSⅠ的能量分配表现为Y（Ⅰ）显著降低，Y（NA）显著升高，Y（ND）保持稳定，PSⅠ供体侧性能受到限制。

6 总结与展望

820 nm光吸收曲线技术能快速和无损伤地测定PSⅠ内光能的利用率、光保护机制、是否受到光损伤及引起受伤的作用位点，被广泛应用于低温弱光胁迫、干旱胁迫和酸胁迫等研究，而对重金属和土壤盐碱化等非生物因子胁迫下PSⅠ性能还需进一步研究[28]。虽然利用820 nm光吸收曲线技术可以保持叶片活性，进行长期连续性监测，但无法揭示PSⅠ反应中心各种蛋白的结构与功能在胁迫下的具体变化，因此应结合分子生物学和生物化学等多个学科，共同研究揭示PSⅠ变化机理[29-30]，为生态修复中筛选抗性植物[31]、培育高产耐性植物及监测环境污染对光合作用影响等方面提供理论基础。