MET突变与非小细胞肺癌患者临床病理特征及预后的关系

杨 爽，冯卫能，张 华，梁剑苗 （广东省佛山市第一人民医院头颈胸肿瘤内科，广东佛山528000）

非小细胞肺癌(NSCLC)早期症状不典型，确诊时多处于晚期，失去手术机会，主要通过放疗和化疗延长生存期，但传统放疗、化疗效果不佳[1]。有报道显示NSCLC驱动基因靶向药物靶点确切、疗效佳、不良反应少，能显著改善NSCLC患者预后[2]。间质-上皮细胞转化因子(MET)是目前NSCLC分子治疗的又一重要靶点[3]，但MET基因突变与NSCLC患者病理特征及预后有何关联尚不清楚。本文回顾性分析NSCLC患者的临床资料，探讨MET突变与NSCLC患者病理特征及预后之间的关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料

经医学伦理委员会批准，回顾性分析我院2014年1月－2015年1月收治的315例NSCLC患者临床病案资料。诊断标准：参照《非小细胞肺癌免疫组化标志物专家共识(2014)》[5]。纳入标准：⑴经组织病理学确诊NSCLC患者；⑵年龄≥18岁。排除标准：⑴精神障碍者；⑵合并严重肝、肾功能障碍；⑶合并血液系统、免疫系统疾病；⑷N3期及以上患者。315例中男167例，女148例；年龄41～73岁，平均年龄(62.51±6.30)岁；鳞癌169例，腺癌146例；病理分期：Ⅰ期65例，Ⅱ期94例，Ⅲ期119例，Ⅳ期37例。所有患者均签署知情同意书。所有患者随访直至死亡。

1.2 方法

组织标本：均来源于临床穿刺取样，石蜡保存、切片。

NGS检测方法：(1)DNA提取和定量。于室温环境中解冻细胞颗粒后，尽量删除媒体或PBS解冻丸。DNA提取采用DNeasy血液组织工具(Hilden，德国)。纯化后的DNA通过Nanodrop One(Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)鉴定合格，并且采用制造商的推荐使用dsDNA HS检测试剂盒(Life Technologies，Eugene，OR，USA)通过Qubit 3.0 (Life technology，Singapore，Singapore)定量。(2)测序准备：测序库采用KAPA Hyper准备试剂盒(KAPA Biosystems，南非)，将50 ng-1 μg的DNA基因组片段剪成350个基点，接受End-repairing，与索引适配器连接后，选择使用Agencourt AMPure XP珠子，最终通过PCR扩增文库，纯化，富集目标。(3)杂交捕获和测序：加入人gt -1 DNA (Life Technologies)和xGen Universal blocking oligos (Integrated DNA Techno-logies)作阻断剂。用geneseeq422探针(geneseeq1)进行杂交富集。捕获反应用NimbleGen SeqCap EZ杂交、Wash试剂盒(Roche，Madison，WI，USA)以及Dynabeads M-270(Life Technologies，维尔纽斯，立陶宛)进行，并采用优化制造商协议。捕获的文库是用Illumina p5 (5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3') 和p7引 物(5'-CAAGCAGAAGACGGCAT ACGAGAT-3')扩增的珠上文库(KAPA HiFi HotStart ReadyMix, KAPA Biosystems，开普敦，南非)。捕获后的扩增文库由agt AMPure XP beads纯化，使用KAPA文库定量试剂盒(KAPA Biosystems，Cape Town，South Africa)进行qPCR定量。文库片段大小由安捷伦科技2100生物测定。

1.3 评价指标

检测结果和生存情况：统计所有患者的MET突变情况、中位生存期。

MET突变与NSCLC病理特征的关系：分析患者的临床资料，从年龄、性别、吸烟与否、组织类型、肿瘤分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移等方面分析与MET突变的关系。

MET突变与NSCLC预后的关系：从患者年龄、性别、吸烟情况、肿瘤分期、病理类型、MET突变方面评价NSCLC患者的中位生存期。

NSCLC患者预后的多因素分析：采用Cox模型进行多因素影响分析。

1.4 统计学处理

采用SPSS19.0软件统计分析，计量资料以±s表示，采用独立样本t检验，计数资料比较采用卡方检验，MET突变与NSCLC预后关系采用Log-rank检验，采用Cox进行回归分析影响预后的因素。检验水准=0.05。

2 结果

2.1 检测结果和生存情况

315例NSCLC患者中MET突变阳性34例，MET突变阳性率为10.79%；随访结果显示，315例患者的中位生存期为31个月。

2.2 MET突变与NSCLC病理特征的关系

表1 MET突变与NSCLC病理特征的关系

MET突变与NSCLC患者的年龄、性别、吸烟情况、肿瘤分期、组织类型、肿瘤浸润深度、淋巴结转移情况、远处转移情况均无关(P>0.05)，见表1。

(续上表)

2.3 MET突变与NSCLC预后的Log-rank分析

影响NSCLC预后的因素有TNM分期及MET突变(P<0.01)，NSCLC的预后与患者年龄、性别、吸烟情况、组织类型无关(P>0.05)，见表2。

表2 MET突变与NSCLC预后的Log-rank分析

2.4 影响NSCLC预后的多因素Cox回归分析

将NSCLC患者TNM分期情况Ⅰ/Ⅱ期赋值为0，Ⅲ/Ⅳ期赋值为1，MET突变阳性赋值为0，阴性赋值为1，经Cox回归分析显示MET突变和TNM分期是NSCLC患者预后的独立影响因素(P<0.01)，见表3。

3 讨论

据世界卫生组织统计，全球每年肺癌发病例数超1 000万，占恶性肿瘤新发病例数的13%，因癌症而死亡的患者中肺癌占19%，肺癌发病率和病死率居恶性肿瘤首位[6]。肺癌中NSCLC发病率占80%～85%。虽然目前肺癌病死率仍然极高，但某些特定基因突变的NSCLC患者经靶向治疗，预后得到了明显改善[7]。随着医学分子生物学研究发展，人们对肿瘤驱动基因的认识逐渐深刻，通过检测NSCLC患者肿瘤异质性并制定个体化治疗方案已成为新趋势。目前络氨酸激酶抑制剂已被批准临床用于治疗表皮生长因子受体(EGFR)重排的NSCLC患者，且靶点确切、疗效佳、不良反应小，能显著改善患者预后。而其他在NSCLC患者中已知的基因改变，如FGFR1、KRAS、NRAS、MET等也是目前研究热点。其中MET基因突变被认为是继EGFR之后又一个NSCLC分子治疗的重要靶点，但目前临床研制的靶向MET和其配体HGF的药物均以失败告终。因此本文回顾性分析我院NSCLC患者资料，通过NGS法检测MET基因突变情况，探讨MET突变与肺癌患者病理特征和预后的关系，为临床研究提供科学依据。

临床研究发现MET突变不与其他基因突变共存，提示MET突变可能是一种独立的致癌驱动基因[8]。MET突变包括体系突变和种系突变。在NSCLC患者中，MET基因主要突变于sema结构和JM结构。研究表明sema结构域中有多种错意突变如S178、L211W会影响MET和HGF的结合和下游信号激活过程[9]。而JM结构域的Tyr1003发生点突变成为苯丙氨酸时，会影响MET泛素化和降解，从而持续激活MET通路。MET与EGFR同位于7号染色体，编码蛋白同样属于受体络氨酸激酶，MET突变导致持续高度磷酸化会激活MET/HGF信号通路，促使NSCLC的发生、浸润、转移、分裂加速等。但同时有研究指出，MET基因的异常如扩增、过度表达、外显子突变等与NSCLC患者病理特征无显著相关性[10]。近年除对MET扩增研究较多外，MET14外显子突变也是研究的重点项目，且有相关证据指出MET14外显子突变采用克唑替尼治疗预后较MET扩增优。也曾有学者研究发现，MET基因突变与NSCLC患者吸烟有一定关联性[12]。但因其研究样本量过小，结论尚存在争议。本文中，经单因素分析结果显示，MET 突变与患者吸烟与否无明显相关性，与报道结论不一致。文献结果表明MET基因突变易出现在腺癌患者中[11]。本文结果中腺癌患者出现MET突变19例，鳞癌患者出现MET15例，腺癌患者MET突变率略高于鳞癌，但差异不明显。回顾性分析结果显示，NSCLC患者的年龄、性别、肿瘤分期、组织类型、肿瘤浸润深度、淋巴结转移情况、远处转移情况与MET突变均无明显关系，这可能与本研究中纳入样本量过少有关。

表3 影响NSCLC预后的多因素Cox回归分析

相关报道指出原癌基因MET编码的MET蛋白是50×103的α亚基以及145×103的β亚基经二硫键连接而形成的异二聚体。MET受体和其配体HGF结合后会激活受体发生磷酸化，导致多种底物蛋白发生磷酸化并传导细胞内一系列信号，激活PI3K/AKT、MEK/ERK等通路，产生多种生物效应如促进细胞增殖、侵袭、运动、改变血管形态、调节血管形成等，从而影响预后。李佳浓等[9]研究发现MET突变阳性NSCLC患者中位生存期显著低于MET突变阴性者，且经多变量模型证实MET阴性NSCLC患者能显著降低死亡风险。本文结果也显示MET突变阳性者的平均生存期显著低于MET突变阴性者，且MET突变是NSCLC患者预后的独立危险因素。

综上所述，MET突变是NSCLC预后的独立危险因素，MET突变阳性的NSCLC患者预后较差，MET突变与NSCLC患者病理特征则无明显关系。