miRNA-146a靶向干预改善晚期APP/PS1双转基因模型小鼠认知功能的实验研究

麦 晖 ， 范炜豪 ， 陈雄金 ， 赵 斌 （广东医科大学附属医院 . 神经病学研究所；. 神经内科，广东湛江 5400）

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是发生于老年和老年前期的一种渐进性的神经退行性疾病，是老年人中最常见的痴呆性疾病。据统计，65岁以上老年人约有5%患有AD，至2015年我国AD患者超过900万人，患病人数居世界第一，预计至2050年我国老龄化人口将超过4亿人[1]。AD发病后难以治愈，目前主要的疗法只限于短期缓解发病症状。临床药物如胆碱酯酶抑制剂或谷氨酸受体拮抗剂只能改善症状，不能彻底治愈，而治疗AD的药物临床试验进展不尽人意，AD的发病机制、实际治疗策略及新的治疗靶点均有待进一步研究[2]。MicroRNA(miRNA)是一类在生命进程中具有保守性及稳定性的内源性非编码RNA。miRNA通常被认为是细胞命运的决定因素，是各种脑部疾病的关键调节因子，有望成为治疗神经退行性疾病的靶点[2-3]。miRNA-146a是AD与炎症有关的一种miRNA，它可以调控先天免疫。AD脑解剖病理结果提示，在海马和颞叶皮层，miRNA-146a表达上调；而在未受影响的区域miRNA-146a 水平保持不变[4]。此外，miRNA-146a不仅参与调节先天免疫，还影响造血功能和细胞分化等[5-6]。前期研究发现，miRNA-146a在AD发病过程中具有重要的作用，可能是AD的一个潜在新靶点[7]。目前大众对AD 的认识普遍不足，临床上确诊的AD患者大多已处于晚期，给社会和家庭带来了沉重的负担。本研究试图通过实验研究明确miRNA-146a是否能改善晚期APP/ PS1双转基因模型小鼠的行为认知功能，是否为AD 的潜在治疗靶点，为AD患者新型药物的研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 试剂

miRNA-146a agomir 和DEPC(diethyl pyrocarbonate) 为广州艾基生物技术有限公司产品；Aβ42 ELISA试剂盒为美国invitrogen公司产品；六氟异丙醇(HFIP) 为美国Sigma公司产品；OCT包埋剂为美国樱花SAKURA公司产品；Aβ抗体、Aβ42抗体、P-tau T181、tau 46、β-actin 抗体、HRP标记二抗为美国CST公司产品；Flour 488荧光二抗、DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)、 P-tau S396抗 体 、 P-tau T205抗体为英国abcam公司产品；脱脂奶粉为美国BD公司产品。

1.2 实验动物

SPF(specific pathogen free)级18月龄APP/PS1双转基因小鼠12只，18月龄相同背景非转基因野生型小鼠(C57BL/6型，简称C57小鼠)6只，均为雄性。试验动物由广东省实验动物中心提供，饲养于广东医科大学实验动物中心SPF级房，22～26 ℃，湿度为55%～65%，12 h光暗周期条件下饲养(早上7点打开照明装置，19时关闭照明装置)，自由获取食物和水源。本实验已通过广东医科大学伦理委员会审核，遵循相应动物实验操作规范。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组 随机将18月龄AD小鼠分为AD组和ADI组(干预组)，每组6只，18月龄C57小鼠6只作为CON组。

1.3.2 动物给药 实验动物按照Hanson等[8]方法予小鼠鼻腔滴注给药。(1) 将实验剂量1 nmol miRNA-146a agomir溶于24 μL无酶的DEPC水中，冰盒中保存。(2) 在正式实验前2周，用2.5 μL移液枪给小鼠用生理盐水滴鼻。正式实验时，ADI组给予miRNA-146a agomir，每次1 μL，两个鼻孔交替滴注，总量达8 μL 后，给予小鼠休息5 min， miRNA-146a agomir充分吸收后，再进行下一个轮回，3个轮回将24 μL滴注完。隔天干预1次，共15次。AD组和CON组小鼠均给予同等体积的载体DEPC水。

1.3.3 Morris水迷宫检测 30 d给药结束后，全部小鼠开始进行Morris水迷宫测试，用于考察实验小鼠的学习记忆情况。Morris水迷宫行为检测系统由圆形水槽、平台和数据采集系统组成。(1)定位航行实验：定位航行实验用于测量小鼠对水迷宫学习和记忆的能力，共历时5 d，平台固定在NW象限下1 cm，每天每只小鼠连续训练4次。训练时每次将小鼠从不同象限边缘中点位置面向池壁放入水中，观察并记录小鼠在90 s内找到平台的时间(平台上停留时间超过10 s)，即为逃避潜伏期。如果小鼠在90 s内未能找到平台则人为引导至平台，停留10 s后移开，逃避潜伏期记为90 s。每次训练完后，用干毛巾擦干小鼠，防止低体温造成的应激干扰结果。(2)空间搜索实验：空间搜索实验用于测量小鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的能力。实验第6天时撤除平台，选SE象限将小鼠面向池壁放入水中，记录90 s内小鼠穿越平台所在位置次数、在平台所在象限的停留时间及游泳路程百分比。

1.3.4 Y迷宫检测 Y迷宫主要应用于动物的辨别性学习、工作记忆和参考记忆的测试。Y迷宫用医用有机板制作，内外壁贴黑色胶纸，共3个臂，各臂夹角为120°，每一臂尺寸为30 cm×8 cm×15 cm(长×宽×高)，中央处各有1个可移动的隔板，在迷宫各个臂内贴上不同的几何图形，作为视觉标记。每个Y迷宫的3个臂被随机设为新异臂、起始臂和其他臂。新异臂：在实验的第一阶段即训练时期用隔板挡住，在第二阶段即测试期打开；起始臂：小鼠进入迷宫所在的臂。整个实验过程中起始臂和其他臂都是一直打开，动物可以自由出入。迷宫内铺垫木屑，每次训练或测试结束后，混匀各个臂的木屑，以防止动物残留气味干扰。迷宫上方1.5 m处安置摄像头，全过程录像。检测小鼠自发性交替反应和空间识别能力。

1.3.5 小鼠海马组织样品的准备 磁共振检测完成后，各组小鼠用10%水合氯醛(按照0.35 mL/100 g)腹腔注射，麻醉后心脏右心耳小剪刀剪开小口，左心室快速灌注4 ℃预冷的生理盐水，至右心耳流程清亮液体，肝脏发白后，改用4 ℃预冷4 %多聚甲醛快速灌注，随后断头取脑，脑组织沿矢状面一分为二。其中一侧脑组织迅速分离出海马组织置于－80 ℃保存备用，进行后续分析；另一侧脑组织置于4 ℃预冷的4 %多聚甲醛-PBS(phosphate buffer saline)溶液(pH=7.4)中固定过夜，OTCB包埋，然后按冠状面将组织切成25 μm厚的冰冻薄片，用贴片法将脑片吸附于防脱片玻片上，按不同实验组将片放置于切片盒－80 ℃低温冰箱保存备用。

1.3.6 免疫荧光检测 冰冻切片免疫荧光检测小鼠颅内Aβ/Aβ42蛋白含量。具体步骤如下：将脑组织片从-80 ℃冰箱取出，放置在片架上置入37 ℃温箱30 min，用免疫组化笔做好标记后置入玻璃染缸中给予PBS(pH 7.2～ 7.4)，室温下洗3次，每次5 min。随后加10 %同源羊血清(与二抗同来源)于湿盒中常温封闭1 h。封闭结束后将其中的封闭液吸干，滴加一抗，置入湿盒中4 ℃冰箱孵育过夜。第2天，从4 ℃冰箱中取出湿盒，室温下复温1 h，随之置入玻璃染缸中给予PBS，室温下洗3次，每次5 min。避光用移液枪滴加配制好的荧光二抗(采用封闭液稀释)，后将湿盒置入37 ℃恒温箱中孵育1 h，从温箱取出后予PBS室温下洗3次，每次5 min。待片子干后，滴加DAPI，避光室温孵育3 min，随后置入玻璃染缸中室温下PBS洗3次，每次5 min，风干后加入放猝灭剂并盖上玻片。TCS SPE5 莱卡共聚焦显微镜下观察海马区荧光表达情况。Aβ一抗1:100稀释、Aβ42一抗1:1 600稀释，二抗均按1:1 000稀释。

1.3.7 ELISA法检测Aβ42含量 按照说明书要求进行ELISA检测Aβ42含量，具体步骤如下：从－80 ℃冰箱取出各月龄小鼠每个样本海马组织(约30 mg)，冲洗干净后，按每100 mg样本加入含1×蛋白水解酶抑制剂1.0 mL的PBS进行匀浆，4 ℃ 15 000 r/min离心30 min后收集上清，分装、标记。在离心后的沉淀物中加入1 g/L六氟异丙醇200 mL后震荡混匀，离心收集上清，分装、标记。然后按照操作手册分别检测可溶性和不可溶性Aβ42水平。

1.3.8 Western blotting检测 按等质量取已提纯的海马组织蛋白30 μg进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，接着将目标蛋白从凝胶中转移至PDVF(polyvinylidene fluoride)膜上，用TBST(Tris-Buffered Saline Tween-20)溶液洗涤：每次5 min，共3次；将PVDF膜放入 5%脱脂奶粉溶液中常温封闭2 h(摇床中慢摇)；用 1%的脱脂奶粉稀释一抗(兔抗P-tau S396，1:500稀释；兔抗P-tau T205，1:1 000稀释；兔抗P-tau T181，1:500稀释；兔抗tau46，1:500稀释；内参β-actin，1:1 000稀释)，4 ℃摇床过夜；次日常温复温40 min，用TBST洗涤3次，每次5 min；洗完后用1 %的脱脂奶粉稀释二抗(HRP标记的羊抗兔二抗，1:20 000稀释)，37 ℃摇床孵育2 h。用TBST溶液洗涤3次，每次10 min；暗房避光，ECL法化学发光显影、定影。胶片曝光后用扫描仪进行条带扫描，灰度分析结果。

1.4 统计学处理

采用 Graphpad Prism 6.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，采用one-way ANOVA及q检验分析各组样品数值间的差异。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学检测结果

2.1.1 Morris水迷宫检测结果 如图1A所示，在定位航行训练实验中，随着训练时间的增加，各组小鼠找到平台的时间(即逃避潜伏期)逐渐缩短。与AD组小鼠相比，ADI组小鼠在定位航行实验2、3、4、5 d的逃避潜伏期明显缩短，定位巡航运动轨迹也同样明显缩短，差异均有统计学意义(P<0.01)。图1B～D所示，与AD组小鼠相比，ADI组小鼠在原平台所在象限停留时间及游泳路程百分比都明显增加，差异有统计学意义(P<0.05或0.01)；而穿越原平台次数虽略有增多，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.1.2 Y迷宫方法检测结果 在自发交替反应中，ADI组小鼠正确率较同月龄AD组小鼠虽略有增加，但差异无统计学意义(P>0.05)；ADI组小鼠在新异臂的停留时间以及在穿越新异臂的次数均比同月龄AD组小鼠明显增加，差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。详见图1E～G。

2.2 miRNA-146a agomir对 APP/PS1小 鼠 脑 组 织Aβ和Aβ42沉积的影响

ADI组小鼠与AD组比较，海马区Aβ和Aβ42沉积斑数量(绿色荧光)均显著降低(图2A)，两组海马可溶性和不可溶性Aβ42含量的比较差异亦有统计学意义(P<0.05或0.01，图2B～C)。

2.3 miRNA-146a agomir对APP/PS1小鼠海马区tau蛋白异常磷酸化水平的影响

图1 18月龄3组小鼠行为学检测结果

如图3所示，AD组小鼠与CON组相比，海马组织中P-tau S396、 P-tau T181和P-tau T205蛋白异常磷酸化水平明显增加；ADI组小鼠与AD组相比，海马海马组织中P-tau S396、P-tau T181和P-tau T205蛋白异常磷酸化水平明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05或0.01)。

3 讨论

AD是一种错综复杂的多病因和多发病机制的神经退行性疾病，由多个基因、通路以及蛋白的失调引起，到目前为止其发病机制尚不明确。研究表明，神经内分泌免疫网络失调也是AD发病的机制之一，且在AD的发病机制中处于核心地位[9-10]。身体的免疫系统炎症与AD密切相关，而先天性免疫系统对脑代谢、神经保护和修复等方面是至关重要的。一旦免疫系统和炎症信号途径被激活，机体就会产生过量的氧自由基，同时促炎性细胞因子以及前列腺素也会大量表达，进而引发炎症级联反应，Aβ异常沉积及tau过度磷酸化，最终导致突触降解和神经元死亡，从而导致神经退行性疾病和AD的发生和进展[10-12]。

miRNAs已经成为基因表达的关键调控因子，并且被证明可影响多种细胞生物学过程，包括增殖、分化、存活和迁移等[13-15]。中枢神经系统中也有自己独特的miRNA，参与神经系统疾病的生理、病理及生物反馈过程，如神经细胞发育、胶质细胞增生、神经细胞凋亡及坏死等。在AD患者海马中检测到多种 miRNA， 如 miRNA-16、 miRNA-34c、 miRNA-107、miRNA-128a和miRNA-146a[3,16]。miRNA-146a免疫炎症相关的靶基因，包括IRAK1、TRAF6、CXCR4、CFH、COX2、ROCK1、EGFR、Notch1和STAT1[17-18]，参与了多种病理、生理过程和疾病相关的免疫炎症反应[5,19-21]。miRNA-146a还可作用于APP金属蛋白酶10(ADAM10)的关键调节因子跨膜四旋TSPAN12，从而影响Aβ的代谢[22]。而β样淀粉蛋白在脑内沉积对神经细胞的毒性是AD发病的关键因素[23]。近年来也有研究认为Aβ是tau的上游调节途径，其毒性引起tau功能异常。换而言之，tau过度磷酸化通常被认为是淀粉样变性的结果，而不是该疾病发病机制中的一个独立事件[24]。反之异常磷酸化的tau也可增加Aβ的毒性[25]，两者相辅相成。

图2 miRNA-146a agomir干预后 APP/PS1小鼠脑组织海马区Aβ的沉积情况

图3 miRNA-146a agomir干预后APP/PS小鼠海马中tau蛋白磷酸化情况

Morris水迷宫是目前评价动物学习与记忆的应用最广范的模型，可用于测试实验动物对空间位置觉和方向觉(空间定位)的学习记忆能力。Y迷宫实验模型用来研究啮齿类动物的空间识别记忆能力。相对于被动回避等实验，这种迷宫利用了啮齿类动物对新异环境天然探究的自然习性，不需要动物学习任何的规则来趋利避害，能够有效地反映动物对新异环境的识别记忆能力。在本研究中2个迷宫测试结果均有力证实了miRNA-146a agomir 靶向干预后，明显改善了晚期AD模型小鼠的行为认知能力。分子层面上，我们发现干预后的AD模型小鼠其海马区Aβ、Aβ42蛋白的沉积及tau蛋白的异常磷酸化水平与AD 正常小鼠相比明显降低。结合目前公认的AD典型神经退行性病变的主要表现为：(1)学习记忆力功能减退及损伤；(2)不同脑区(包括海马、皮质等)Aβ聚集形成老年斑(SP)；(3) tau 蛋白过度磷酸化聚集形成神经原纤维缠结(NFTs)；(4)大量神经元损伤和数目的减少，突触功能紊乱以及严重的轴突和树突骨架的破坏[26-27]。某种程度上可以说，miRNA-146a agomir干预后全面缓解了AD模型小鼠的病理、生理进程，在活体动物实验中表现为行为认知能力得到明显改善。

综上所述， miRNA-146a agomir靶向干预可改善晚期AD小鼠的行为认知功能障碍，降低AD小鼠海马区Aβ、Aβ42蛋白的沉积及tau蛋白的异常磷酸化水平，缓解AD病理、生理进程。本研究为寻找AD治疗的新靶点提供了新的线索和思路。