黄芪-丹参对LPS诱导的小鼠巨噬细胞焦亡的影响

王丽娜，罗 竹，黄小朵，徐昌君，严春兰，骆进程，杨长福

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550002)

特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF)是一种会引起肺间质胶原蛋白增生，破坏正常肺泡结构，最终导致肺泡数量减少、闭锁的疾病。IPF发病早期细胞外基质(Extracellular Matrixc，ECM)沉积伴随大量炎症细胞浸润[1]。相关研究显示IPF发病广泛，主要以中老年人为主，并且患病率呈现上升趋势[2]，且一旦确诊为该疾病，预后差，生存期短，严重影响生活质量。目前，临床主要以西医激素类药物治疗为主，激素类药物对IPF具有良好的抑制作用。

目前，中医治疗IPF引起社会各界广泛关注。本课题组前期研究发现加减补肺汤(黄芪、党参、百部、补骨脂、桑白皮、丹参)能改善博来霉素诱导的肺纤维化大鼠炎性细胞浸润，减轻肺纤维化程度[3]。黄芪、丹参是临床常用药物，可以组成药对，从而扩大药物疗效。有实验研究提示，黄芪、丹参可抑制COPD 肺组织大鼠 NF-κB活化，有利于减轻气道重构[4]，课题组前期研究发现黄芪-丹参药对在动物实验中可以有效抑制炎症，但是否能够在体外实验中起到相应的作用，目前还缺乏研究。故本实验研究黄芪-丹参药对通过体外实验对小鼠巨噬细胞活化后炎症的影响，并探讨其与焦亡相关的可能性。

1 材料

1.1 动物及细胞株

SPF级雄性SD 大鼠20只，体质量200～220 g，许可证号SCXK(湘)2014-0011，购于长沙天勤生物技术有限公司。RAW264.7单核细胞巨噬细胞，干细胞库编号ZQ 0098，购于上海中乔新舟有限公司。

1.2 药物

黄芪购自贵州同济堂中药饮片有限公司，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为豆科植物蒙黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。

丹参购自贵州同济堂中药饮片有限公司，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为唇形科植物SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根，根据《中国药典》2015版，称取丹参15 g。

黄芪-丹参药对：根据《中国药典》2015版，称取黄芪47 g，丹参23.5 g，以1倍量水量取，10倍量水浸泡，用武火煮开后文火煎煮30 min，滤过，残渣加8倍量水再煎煮2次，滤过，合并滤液，浓缩过滤药物至50 mL，取30 mL备用，药物浓度为0.47 g/mL。

脂多糖(LPS)：北京索莱宝科技有限公司，批号：Lot.No.320V033。

1.3 主要试剂及仪器

DMEM培养液(美国Hyclone 公司，批号LOT NO.：319005121)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批号18050302)；台盼蓝染色液(北京索莱宝科技有限公司 Lot No.20151026)；CCK-8检测试剂盒(东仁化学科技上海有限公司，批号Lot NN710)；BCA 蛋白定量试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20180629)，小鼠IL-1β ELISA试剂盒(爱必信(上海)生物科技有限公司，Lot#AB02)；抗体TNF-α(英国Abcam公司，ab1793，批号：GR54204-2)；抗体NF-κB(碧云天 AF1234)；蛋白提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号：Lot.No.20190719)，L600台式低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，编号：7111040047)，Bio-Rad 蛋白凝胶电泳仪(BIO-RAD公司，批号：10006938RevB)，PVDF膜(德国默克公司，Lot.No.R8BA4734F)，SDS-PAGE 凝胶试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，BIO-RAD半干转电转仪(批号：690BR023628)，5×电泳液(索莱宝公司，Lot.No.20181022)，转膜液(Bio-Rad公司，cat.#10026938)，10×TBST(索莱宝公司，Lot.No.20181101)，膜再生液(北京索莱宝科技有限公司，Lot.No.20180508)，ECL 超敏发光液(北京普利莱基因技术有限公司，Lot.#1815a01)；BIO-RAD 凝胶成相系统(美国 Bio-Rad 公司)。

2 方法

2.1 含药血清的制备

20只SD大鼠随机分为两组，正常组(10只)、黄芪-丹参药对组(10只)，适应性喂养3d后，进行大鼠灌胃，黄芪-丹参药对组：药对黄芪-丹参浓缩液0.47 g/mL/d(人与大鼠表皮面积换算公式=标准质量/人的体重×6.3)；空白组给予等剂量自来水灌胃，连续灌胃1周，每天1次，灌胃期间，正常饮食饮水。第7天灌胃2 h后，大鼠麻醉，用一次性无菌注射器腹主动脉取血，收集血清于离心管中，室温静置30 min，4 ℃，3 500 r·min-1离心10 min，取细胞上清液，0.22 μm的微孔滤膜过滤，分装，-80 ℃保存，使用前56 ℃水浴灭活30 min。

2.2 CCK-8 检测不同浓度LPS 诱导的RAW264.7 巨噬细胞活力

取生长至满足条件要求的巨噬细胞(聚合度80%)，胰蛋白酶消化并离心后，重置细胞悬液并取适量用细胞计数仪计数，剩余细胞悬液稀释至合适的密度，按照分组情况接种到无菌96 孔板中，每孔加入100 μL(约8 000个细胞)，12 h后，按0，1，2.5，5，10，25，50，100 μg/mL的LPS 浓度进行刺激，每组设4 个复孔，做好相应标记。于37 ℃，5%CO2恒温培养箱中培养12 h 后，每孔分别加入10 μLCCK-8 液，用酶标仪检测450 nm光密度值时各组吸光度A，根据细胞活力值=[(实验组-空白组)/(对照组-空白组)]×100%计算各组细胞活力值。

2.3 细胞分组与造模

将RAW264.7 细胞随机分为3组，分别为空白含药血清组(20%空白血清+10 μg/mL LPS)，模型组(10%空白血清+10 μg/mL LPS)，黄芪-丹参药对含药血清组(20%含药血清+10 μg/mL LPS)。RAW264.7 巨噬细胞汇合度达到约80%时，PBS 润洗3遍，按上面的分组，加入10 mg·L-1LPS造模，12 h后弃去废液，PBS润洗，加入如上分组浓度的含药血清和胎牛血清浓度，置于温箱中培养24 h。

2.4 ELISA 法检测RAW264.7 巨噬细胞IL-1β的浓度

按照上述方法，细胞置于温箱培养24 h后，收集上清液备用，于-20 ℃保存。准备ELISA试剂盒和样品，放置至室温，大约20 min。按照说明书配置1×清洗液，1×抗体稀释液，按要求稀释检测抗体、HRP，配置底物溶液等相关溶液。室温后，先于包被抗体的96孔板中依次加入对照品和各组样品，每孔100 μL，设置复孔，室温2 h后，清洗液清洗3次，最后1次倒扣96孔板，吸干孔内残留液体。加入稀释后的检测抗体，每孔100 μL，室温1 h后，清洗，方法同上。加入100 μL HRP稀释液，室温20 min后，清洗。加入100 μL底物溶液，室温20 min后，清洗。加入50 μL终止液，30 min内，用酶标仪设置波长450 nm，检测各组OD值。

2.5 蛋白免疫印迹法(Western blot)测定通路蛋白TNF-、NF-κB的表达

按照“2.3”的细胞培养方法，24 h后，收集上清液，PBS润洗后，细胞刮收集细胞，离心，细胞沉淀加入含1% PMSF的RIPA高效裂解液裂解细胞蛋白，冰上裂解25 min，4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min，收集上清液，取4 μL稀释后样品做BCA定量，得到标准品与样品吸光值，绘制标准曲线，计算蛋白样品原液浓度，配平后加入5×蛋白上样缓冲液，100 ℃灭活10 min，并置于-20 ℃保存备用。制胶，蛋白上样，SDS-PAGE 凝胶电泳，半干转转膜，5% 脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h，敷目的蛋白对应的特异性抗体TNF-(1∶500)、NF-κB(1∶1 000)，4 ℃过夜，摇床洗膜5 min/次，共3次，加入相应二抗(1∶5000)室温孵育1 h，摇床洗膜5 min/次，共3次，配置化学发光液，显影，拍照保存，用 Image J图像分析软件测定条带的灰度值。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 CCK-8法检测不同浓度的LPS对RAW264.7巨噬细胞活力值的影响

细胞发生炎症反应，内毒素脂多糖(LPS)的刺激是炎症反应发生的重要原因，从而诱导巨噬细胞活化。实验结果显示，LPS药物浓度在1～100 μg/mL时，巨噬细胞活力值会有峰值变化，其中在浓度10 μg/mL时，巨噬细胞活力值达到最高峰，其余均呈现逐渐降低的趋势。故本实验均采用10 μg/mL的LPS药物浓度来诱导巨噬细胞的炎症模型。见表1。

组别质量浓度A活力值空白-0.459-10.4030.810±0.5392.50.4090.820±0.50250.4400.966±0.327LPS100.7812.527±1.436250.6041.992±2.155500.6371.817±0.3271000.6331.793±0.670

3.2 ELISA检测巨噬细胞外炎症因子IL-1的表达

LPS激活后的巨噬细胞可以在细胞膜外释放大量的炎症因子IL-1，扩大炎症反应。实验结果显示：与空白组比较，模型组IL-1浓度升高明显(P<0.01)；与模型组相比，药对组的浓度呈现下降的趋势(P<0.05)。见表2。

表2 黄芪-丹参药对对IL-1浓度的影响

组别浓度(pg/mL)空白组28.108±3.459模型组67.530±10.5468##药对组50.0986±7.98684##*

注：与空白组相比，##P<0.01；与模型组比，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 Western blot检测TNF-/ NF-κB通路蛋白的表达

免疫蛋白印迹结果显示(图 1)：与空白组比较，模型组TNF-、NF-κB表达水平升高(P<0.05，P<0.01)，与模型组相比，黄芪-丹参药对组能够抑制上述蛋白的表达(P<0.05)，黄芪-丹参药对能够控制炎症，见表3。

注：A.空白组；B.黄芪-丹参药对组；C.模型组

表3 黄芪-丹参药对对巨噬细胞活化后TNF-/NF-κB蛋白表达量的影响

注：与空白组相比，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05。

4 讨论

前期课题组研究加减补肺汤(黄芪、党参、百部、补骨脂、桑白皮、丹参)能够有效改善IPF的疾病发展进程。其中，黄芪和丹参作为临床常用药物，常配伍作为药对使用，可以扩大药效。黄芪具有补气、利尿和排毒的功效，具有抗感染、抗肿瘤、增强免疫力的功效[5]，黄芪当中的活性成分总黄酮和总皂苷能够干预IPF早期肺泡炎症，抑制纤维化的进程[6]。丹参具有活血化瘀、通经和除烦的作用，具有改善微循环、抗肝纤维化的功效[7-8]。丹参素可以改善大鼠早期肺泡炎症和纤维化结节[9-10]。黄芪和丹参作为药对合用，能够对IPF疾病发挥作用，这可能与其能够抑制早期肺泡炎症和肺纤维化结节有关。

细胞焦亡是参与细胞感染过程中的一种炎症细胞死亡过程。当细胞受到外界刺激时，外界刺激物如果突破免疫屏障，会诱导血液中的单核细胞活化为巨噬细胞，释放大量促炎因子，TNF-α作为巨噬细胞释放的关键性促炎因子，广泛参与了免疫应答、炎症反应等病理过程[11]，TNF-α能够刺激巨噬细胞(alveolar macrophage，AM)活化，损伤毛细血管内皮细胞(alveolarepithelial cell，AEC)和上皮细胞[12]，进而引发炎症反应。有研究发现TNF-α可以激活NF-κB信号通路，使 NLRP3蛋白表达，调控 Caspase-1，并释放炎性介质IL-1、IL-18，引起细胞焦亡(pyroptosis)[13-14]，因此，控制巨噬细胞炎症的发生发展与TNF-α/NF-κB信号通路引发的细胞焦亡存在可能性的机制，有待进一步研究。

本研究主要在LPS干预巨噬细胞的模型中观察药对黄芪-丹参对焦亡的影响。实验研究中模型组的炎症指标显著增高，TNF-α、NF-κB、IL-1呈现高表达，黄芪-丹参药对可下调 TNF-α、NF-κB、IL-1表达水平，降低炎症指标及蛋白，对炎症反应起到抑制作用。综上，黄芪-丹参药对可以抑制小鼠巨噬细胞炎症的进程，其机制可能与抑制TNF-α/NF-κB信号通路的焦亡相关蛋白表达水平及炎性介质有关。