西地那非对Caco-2细胞增殖及对NCM460细胞炎症反应的影响

单静博，郭沛艳，陈特长，汪云阳，李晓祺，周 飒，马文建，2*

（1天津科技大学生物工程学院，天津300457；2齐鲁理工学院生物工程系，济南250200）

近年来，结直肠癌（colorectal cancer，CRC）已经被列为全球第三大致命肿瘤，其发病率和病死率都持续增高［1］。全世界范围内每年有140万例新的结直肠癌病例，其中有70万患者死于结直肠癌［2］。绝大多数CRC与以下因素有关，如饮食、运动、体重、食物传播的诱变剂、特定的肠道菌群和慢性肠道炎症等［3］。通常，炎症性肠病（如溃疡性结肠炎或克罗恩病）患者发生结直肠癌的可能性比正常人高2～5倍［4-5］。根据流行病学研究，长期使用消炎药可以降低消化道肿瘤患者的病死率［6］。肠道内稳态的维持也依赖于肠道微生物耐受性和炎症状态之间的平衡［7］。

利用植物来源的化合物、维生素和营养补充剂进行的化学预防被认为是传统的肿瘤预防方法，但近年来，基于炎症在各种肿瘤形成过程中所发挥的作用，人们对其化学预防进行了更广泛的探索。结直肠癌作为一种常见的上皮性肿瘤，潜伏期近20年，在这段较长的时间内，化学预防对于抑制结直肠癌的转移可发挥作用［8-9］。氧化应激是目前已知的CRC的病因，通过DNA损伤和癌基因突变以及肿瘤细胞增殖途径而激活［10-11］。同时氧化应激是细胞与组织的氧化和抗氧化系统之间失衡及氧化自由基和相关活性氧过量产生的结果［10］。外源性天然抗氧化剂具有抗炎作用，可用于化学预防CRC［12-15］。

在人体内，与邻近正常组织细胞相比，5型磷酸二酯酶（PDE5）在结肠癌、膀胱癌、转移性乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和肺癌等多种肿瘤中表达量相对较高［16］。西地那非（sildenafil）作为 PDE5的选择性抑制剂，因其是第1个口服治疗男性勃起功能障碍药物而被人们所知。其结构与环磷酸鸟苷（cGMP）结构相似，通过与PDE5竞争性结合后，可显著提高cGMP水平，激活蛋白激酶G（PKG），PKG激活AMPK和SIRT1，随后通过增强PGC-1α的活性［17］，诱导抗氧化酶的表达，从而抑制活性氧（ROS）的产生［18］。这些研究表明 PDE5可能在肿瘤发生中起重要作用，靶向PDE5可能是一种有广泛前景的抗肿瘤方法。西地那非能抑制ROS的产生，或许可用于化学预防CRC。大量的研究表明，通过外源性ROS可以探究氧化应激的信号传导和细胞毒性反应［19］，但外源性ROS引起的氧化损伤难以直接产生生理状态下细胞所发生的生理反应。甲萘醌（menadione）是一种多环芳香族酮，可作为维生素K合成的前体，通过氧化还原体系不断在细胞体内产生ROS，较高浓度的甲萘醌可诱发与组织损伤、线粒体DNA损伤和细胞死亡相关的氧化应激［20-22］。由于甲萘醌在细胞内可建立内源性ROS，更易观察生理状态下细胞所发生的生理反应，因此本实验以西地那非为研究对象，以甲萘醌诱导NCM460细胞为肠道细胞炎症模型，探讨西地那非抵抗肠道炎症的作用，并研究其对肠道益生菌干酪乳杆菌和鼠李糖杆菌的生长影响，为其发挥肠道保护作用及预防结直肠癌作用提供实验依据及理论参考。

1 材 料

1.1 药品与试剂

西地那非（上海源叶生物科技有限公司）；甲萘醌（美国Selleck Chemicals公司）；活性氧检测试剂盒、一氧化氮检测试剂盒、NG-L-硝基精氨酸甲酯（NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）（上海碧云天生物技术研究所）；eNOS抗体（北京ImmunoWay公司）；p-eNOS抗体（天津市莱博科技有限公司）；p-JNK1／2抗体、p-ERK1／2抗体、p62抗体（上海 Abcam公司）；IL-1β抗体、IL-6抗体、TNF-α抗体（美国 Proteintech公司）；β-actin抗体（美国Signalway Antibody公司）。

1.2 仪 器

CMax Plus光吸收型单功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；紫外分光光度计（北京普析通用有限公司）；Odyssey红外激光成像系统（美国LI-COR公司）；激光扫描共聚焦显微镜（日本Olympus公司）。

1.3 细 胞

人源结肠上皮细胞NCM460（上海慧颖生物科技有限公司）；干酪乳杆菌（Lactobacillus casei，本实验室保存）；人源结肠癌细胞Caco-2（中科院干细胞库／干细胞技术平台）；鼠李糖乳杆菌CICC6141（Lactobacillus rhamnosus CICC6141，中国工业微生物菌种保藏管理中心）。

2 方 法

2.1 西地那非和甲萘醌的配制

避光条件下分别称取一定量的西地那非和甲萘醌固体粉末于EP管中，加入DMSO，摇晃使之充分溶解，使母液浓度为100 mmol／L，过膜除菌后分装于4℃保存。

2.2 西地那非对NCM460、Caco-2细胞增殖的影响

将NCM460、Caco-2细胞分别接种于96孔板下，5%CO2，37℃下过夜孵育，细胞覆盖率达到70%～80%时，设对照组和实验组进行实验，对照组不加西地那非，实验组用 10、20、40、80μmol／L西地那非分别处理细胞24 h，MTT法检测细胞增殖的能力:每组设6个复孔，培养结束后每孔加入5 mg／mL MTT溶液20μL，37℃培养箱避光继续培养4 h，之后弃去培养液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，在酶标仪490 nm波长处测定吸收度。

2.3 西地那非对肠道细胞内NO及ROS水平的影响

将对数生长期的NCM460、Caco-2细胞分别接种于6孔板。待细胞贴壁生长后，设对照组和实验组进行实验。对照组不加西地那非，实验组选取40μmol／L西地那非处理细胞24 h，随后弃掉培养基，PBS清洗3次。分别采用DAF-FM DA探针和DCFH-DA探针法检测细胞内NO和ROS水平:避光条件下，加入稀释好的探针250μL，置于37℃培养箱孵育20 min后，弃掉荧光探针，用PBS洗涤3～5次，于共聚焦显微镜下分别选取激发波长495和488 nm进行观察，并拍照记录结果，检测细胞内NO和ROS水平。

2.4 西地那非对 Caco-2细胞中 eNOS／ERK／JNK通路的影响

将对数期的Caco-2细胞接种在6孔板中，至细胞覆盖率达到80%以上，弃掉上清，加入基础培养基2 mL，设对照组、西地那非组、联合给药组，其中对照组不加药，西地那非组只加入西地那非（终浓度40μmol／L），联合给药组加入西地那非（终浓度40μmol／L）与 eNOS抑制剂 L-NAME（终浓度100μmol／L）的混合液，各组分别处理细胞24 h，用预冷的 PBS清洗3次。Western blot检测各组eNOS、p-eNOS、p-JNK1／2及 p-ERK1／2蛋白表达水平:每孔加入蛋白裂解液150μL，收集蛋白，将经过煮沸、冷却后离心的总蛋白，进行SDS-PAGE电泳（电泳参数:80 V、30 min；120 V、90 min），之后转移到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉溶液将转好的硝酸纤维素膜（NC膜）封闭1 h，TBS溶液洗涤3次，4℃条件下与相应一抗过夜孵育15 h以上。之后回收一抗，PBS洗涤3次，加入二抗（1∶5 000）5 mL于常温条件下避光孵育2 h，重复洗涤，将NC膜平铺于Odyssey红外激光成像系统中，设置程序，进行数据分析，采用Image J软件分析灰度值。

2.5 甲萘醌诱导肠道细胞建立炎症细胞模型

将对数生长期的NCM460细胞接种6孔板。细胞覆盖率达到70%～80%时，设对照组和实验组进行实验，对照组不加甲萘醌，实验组用5、10、20μmol／L甲萘醌分别处理细胞24 h，吸弃培养基，用PBS清洗3次，采取DCFH-DA探针，通过激光共聚焦显微镜及流式细胞术检测各组细胞内ROS水平。为验证实验结果准确性，增加药物处理浓度，同样设对照组和实验组进行实验，对照组不加甲萘醌，实验组用 2.5、5、10、20μmol／L甲萘醌分别处理NCM460细胞24 h，用Western blot检测NCM460细胞各组p62蛋白表达水平。在分子水平上，为进一步证明甲萘醌可诱导肠道细胞的炎症反应，设对照组和实验组进行实验，对照组不加甲萘醌，实验组用5、10μmol／L甲萘醌分别处理细胞24 h，用Western blot检测NCM460细胞各组相关炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表达水平。

为证明甲萘醌可以诱导肠道细胞建立炎症细胞模型，除NCM460细胞外，进一步验证甲苯醌也能引起结肠癌Caco-2细胞炎症反应，以此确定实验结果准确性。将Caco-2细胞接种于6孔板，细胞覆盖率达到70%～80%时，设对照组和实验组进行实验，对照组不加甲萘醌，实验组加入10μmol／L甲萘醌处理细胞24 h，用DCFH-DA探针，通过共聚焦显微镜检测各组ROS水平。用Western blot检测Caco-2细胞各组p62蛋白表达水平及相关炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表达水平。

2.6 西地那非对甲萘醌诱导的NCM460细胞炎症模型的影响

将NCM460细胞接种于96孔培养板及6孔培养板中，设对照组、甲萘醌组、甲萘醌＋西地那非组。其中对照组不加药，甲萘醌组只加入甲萘醌（终浓度10μmol／L），甲萘醌＋西地那非组加西地那非（终浓度 40μmol／L）与甲萘醌（终浓度10μmol／L）的混合液。各组处理细胞 24 h后，MTT法检测各组细胞活性。采用DCFH-DA探针，通过共聚焦显微镜和流式细胞术检测各组ROS水平。Western blot检测各组p62蛋白表达水平及相关炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表达水平。

2.7 西地那非对两种肠道益生菌生长的影响

取干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌的菌液各2 mL，分别接种至MRS液体培养基100 mL中，各自设实验分组为对照组和实验组。对照组不加药，实验组用250、500μmol／L西地那非处理，每组实验设3个平行，37℃摇床培养，在第 0、2、4、6、8、12、24、36 h时，采用紫外分光光度计在600 nm波长处测定各组吸收度，取平均值。以菌体悬液的吸收度（A）为纵坐标，培养时间为横坐标，分别绘制干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的生长曲线图。

2.8 统计分析

采用GraphPad Prism 5.0分析软件进行统计分析，各项指标均以±s表示，使用单因素方差分析（One-Way ANOVA）检验比较各组间显著性差异，P＜0.05被认为具有统计学意义。

3 结 果

3.1 西地那非对NCM460、Caco-2细胞增殖的影响

用不同浓度的西地那非分别作用NCM460、Caco-2细胞24 h后，MTT检测结果表明，西地那非对Caco-2细胞增殖的抑制效果比对结肠上皮细胞NCM460增殖的抑制效果更为显著，由于80μmol／L西地那非对NCM460细胞仍有较强毒性作用，且10和20μmol／L西地那非对Caco-2细胞致死率均未过半，故选择40μmol／L作为西地那非的处理浓度开展后续实验（图1）。

3.2 西地那非对肠道细胞内NO及ROS水平的影响

由图2所示，西地那非处理24 h后，可以增强NCM460细胞（图2-A）及Caco-2细胞（图2-B）内的NO水平，同时降低胞内ROS水平，提示西地那非有可能通过增强细胞内NO水平，抵抗肠道细胞内的氧化应激，预防结直肠癌的发生。

Figure 1 Inhibition of sildenafil on the proliferation of NCM460 and Caco-2 cells（x¯±s，n＝3）***P＜0.001 vs control group

3.3 西地那非对eNOS／ERK／JNK通路的影响

如图3所示，西地那非处理Caco-2细胞24 h后，经Western blot检测，与对照组比较，西地那非组 Caco-2细胞中 eNOS、p-eNOS、p-JNK1／2及p-ERK1／2蛋白表达水平显著上调。与西地那非组相比，西地那非与L-NAME联合用药组中eNOS、p-eNOS、p-JNK1／2及 p-ERK1／2蛋白表达水平明显下调，提示西地那非对于结直肠癌的抑制效果可能与eNOS／ERK／JNK通路相关。

3.4 甲萘醌诱导肠道细胞建立炎症细胞模型

用不同浓度的甲萘醌处理NCM460细胞24 h，经激光共聚焦显微镜观察（图4-A）及流式细胞术检测（图4-B），NCM460细胞内ROS水平升高，且呈现剂量相关性。Western blot检测结果表明，甲萘醌可以上调NCM460细胞内p62蛋白表达水平（图4-C）及相关炎症因子 IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表达水平（图4-D）。为进一步验证以上实验结果，用10μmol／L甲萘醌处理 Caco-2细胞24 h，激光共聚焦显微镜检测结果表明，甲萘醌可以诱导Caco-2细胞内 ROS水平升高（图4-E）。Western blot检测结果表明，甲萘醌可以上调Caco-2细胞内p62蛋白表达水平及相关炎症因子 IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表达水平（图4-F）。以上结果表明甲萘醌可以通过诱导肠道细胞建立炎症模型。

3.5 西地那非对甲萘醌诱导的NCM460细胞炎症模型的影响

与甲萘醌组相比，MTT实验结果表明，甲萘醌＋西地那非组可降低甲萘醌对细胞的毒性（图5-A）。激光共聚焦显微镜（图5-B）及流式细胞术检测（图5-C）结果表明，甲萘醌＋西地那非组可降低了细胞内ROS水平。Western blot检测结果表明，甲萘醌＋西地那非组下调了p62、IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表达水平（图5-D）。表明西地那非可缓解甲萘醌诱导的细胞炎症，减轻甲萘醌对肠上皮细胞的毒性。

Figure 2 Effect of sildenafil on the level of ROSand NO in intestinal cells A:NCM460 cells；B:Caco-2 cells

Figure 3 Effect of sildenafil on the eNOS／ERK／JNK pathway in Caco-2 cells（x¯±s，n＝3）A:Expressions of eNOS，p-eNOS，p-JNK1／2，p-ERK1／2 in Caco-2 cells detected by Western blot；B，C，D，E:Quantitative analysis of protein levels of eNOS，p-eNOS，p-JNK1／2，p-ERK1／2a:Control；b:Sildenafil；c:Sildenafil＋NG-nitro-L-arginine methyl ester***P＜0.001 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，＃＃＃P＜0.001 vs sildenafil group

Figure 4 Menadione induced intestinal cells to establish an inflammatory model（x¯±s，n＝3）A:Effect of menadione on the level of ROSin NCM460 cells detected by laser scanning confocal microscopy（LSCM）；B:Quantitative analysis of the level of ROSin NCM460 cells by flow cytometry（**P＜0.01，***P＜0.001 vs control group）；C，D:Effect of menadione on the expressions of p62（C）and IL-1β，IL-6 and TNF-α（D）in NCM460 cells detected by Western blot；E:Effect of menadione on the level of ROSin Caco-2 cells detected by LSCM；F:Effect of menadione on the expressions of p62，IL-1β，IL-6 and TNF-αin Caco-2 cells detected by Western blot

Figure 5 Effects of sildenafil on inflammatory model of NCM460 cells induced by menadione（x¯±s，n＝3）A:Cell proliferation detected by MTT；B:Levels of ROS detected by LSCM；C:Quantitative analysis of levels of ROS detected by flow cytometry；D:Expression of p62，IL-1β，IL-6 and TNF-αdetected by Western blot a:Control；b:Menadione；c:Menadione＋Sildenafil***P＜0.001 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs menadione group

3.6 西地那非对两种肠道益生菌生长的影响

将不同浓度的西地那非处理干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌36 h，结果表明加入高浓度西地那非对干酪乳杆菌（图6-A）和鼠李糖乳杆菌（图6-B）的生长并无明显影响，证明了西地那非可能在不影响肠道菌群稳态的情况下，发挥抑癌效果。

Figure 6 Effects of sildenafil on the growth of Lactobacillus casei（A）and Lactobacillus rhamnosus（B）

4 讨 论

Sharman等［23］研究发现西地那非可以显著降低小鼠患结直肠癌的风险。同时有研究表明NO可通过上调p-ERK1／2的表达水平诱导肝癌细胞凋亡［24］。本研究结果表明，西地那非对正常结肠上皮细胞无明显毒性，但是对于Caco-2细胞有明显的抑制作用，同时西地那非可以提高肠道细胞内NO水平，通过上调内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）的蛋白表达水平，激活磷酸化的细胞外信号调节激酶（p-ERK1／2）及磷酸化c-Jun氨基末端激酶 1／2（p-JNK1／2），这可能是西地那非抑制Caco-2细胞生长的主要原因。

有研究表明，西地那非存在抗炎潜能［25］。本研究证明西地那非可降低肠道细胞内的ROS水平，进而降低结直肠癌发生的概率。当外界不良因素进入人体会影响免疫系统和胃肠道细胞，在分子水平上触发与炎症相关的信号传导途径，同时诱导促炎细胞因子的反式激活，如肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素1（IL-1β）和白细胞介素6（IL-6），其表达增加可能导致细胞损伤甚至凋亡。p62是一种多功能、应激诱导的支架蛋白，参与多种细胞过程，包括自噬清除、炎症反应调节和氧化还原稳态，研究证明p62与线粒体功能和炎性小体活化有关［26］。本研究采用甲萘醌处理 NCM460细胞及Caco-2细胞24 h，发现甲萘醌可剂量依赖性地升高细胞内 ROS水平，同时上调 p62、IL-6、IL-1β及TNF-α蛋白表达水平，因此建立了甲萘醌诱导结肠上皮细胞的炎症模型，这对今后模拟外界环境因素诱导肠道炎症模型提供了实验参考。最后本研究发现西地那非与甲萘醌联合作用于细胞，可减缓甲萘醌对细胞的毒性，进一步证明了西地那非可以有效地改善肠道细胞炎症反应，通过抵抗外界条件引起的氧化应激反应，预防结直肠癌的发生。

有研究证明干酪乳杆菌［4，27］和鼠李糖乳杆菌［28-30］都具有抗炎及维持肠道菌群平衡的作用。本研究证明西地那非对干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的生长无不良影响。这些结果提示西地那非可能在不破坏菌群平衡的状态下，能够有效地改善肠道细胞炎症反应，通过改善外界条件引起的氧化应激反应，预防结直肠癌的发生。