新型CRM1靶向抑制剂的筛选及其对结外NK／T细胞淋巴瘤细胞增殖的作用

刘美铄，王海娜，龙飞达，冷 楠，杨永亮

（大连理工大学生物工程学院分子药物中心，大连116023）

结外NK／T细胞淋巴瘤（ENKTL）是一种罕见的非霍奇金淋巴瘤亚型，与北美和欧洲相比，亚洲的发病率更高［1］。临床上，ENKTL有很强的耐药性且预后很差［1］。患者晚期的中位生存时间不到几个月，至今还没有有效的治疗方法，因此迫切需要针对ENKTL的靶向治疗进行研究。有研究表明，NF-κB信号通路的上调与ENKTL的发病机制密切相关［2］。因此，使用小分子抑制剂靶向过度激活的NF-κB信号通路是一种非常有希望的治疗策略。

染色体区域维持因子1（CRM1）在肿瘤细胞中过度表达，负责 IκB-α等多种蛋白的细胞核输出［3-5］。靶向抑制 CRM1会导致 IκB-α的细胞核积累，从而下调NF-κB通路的转录活性。本课题组前期的研究报道了中药天然活性成分莱菔素（LFS-01），可以通过共价靶向CRM1选择性杀伤大B细胞淋巴瘤［6］。本研究以LFS-01为母核，设计更有效的CRM1靶向小分子抑制剂LFS-829，分析其对ENKTL的杀伤效果，并探究其作用机制。

1 材 料

1.1 试 剂

CRM1疏水口袋野生型及突变型肽段由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。LFS-829由大连理工大学分子药物中心制备。细胞培养级别二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma公司）；双荧光素酶报告基因质粒p-NF-κΒ-luc和phRL-TK（上海汉恒生物技术有限公司）；RPMI 1640培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；兔抗人CRM1多克隆抗体，兔抗人 p65、P-p65、Cox-2、Bcl-XL和 survivin单克隆抗体，鼠抗人 IκΒ-α、β-actin单克隆抗体（美国 Cell Signaling Technology公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；FITC标记的山羊抗鼠IgG（美国Thermo Fisher公司）；CCK-8试剂盒，蛋白提取、定量、免疫印迹实验相关试剂盒，凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.2 仪 器

MALDI-TOF-MS（Waters中国有限公司）；标准pH计（德国 Sartorius公司）；超纯水系统（美国Millipore公司）；多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）。

1.3 细 胞

人结外 NK／T细胞淋巴瘤细胞株 SNK6、HANK-1购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，来源于ATCC，培养条件为添加了700 U／mL IL-6、10%胎牛血清以及双抗的RPMI 1640培养基。

2 方 法

2.1 计算机辅助药物设计

基于片段的药物设计（fragment-based drug design，FBDD）是一种将随机筛选和基于结构的药物设计（structure-based drug design，SBDD）结合的药物发现新方法。本课题组之前研究发现来自中药的有效成分LFS-01是一种异硫氰酸盐类化合物，为CRM1的靶向抑制剂。为了提高小分子对靶点蛋白的选择性和亲和力，本研究利用基于片段的药物设计的方法，开发新型的CRM1靶向抑制剂。基于片段的药物设计主要分为3个步骤:（1）片段筛选，利用灵敏的检测技术对片段数据库进行筛选，进而发现能与靶蛋白相结合的片段；（2）确定片段与蛋白靶点结合的结构信息，考察结合区域二者之间的相互作用；（3）根据分子片段与靶点的结合结构信息，对片段进行优化和衍生化，构建新的分子。

利用本课题组自主研发的FIPSDock［7］进行受体蛋白和配体小分子之间的分子对接，由小分子亲电弹头能够与靶蛋白的半胱氨酸发生迈克尔加成反应［8］，因此，采取共价对接的方式，将配体分子与靶蛋白的共价结合以可视化的形式展现出来，并根据对接打分进行分子的评价与筛选。

2.2 LFS-829对CRM1作用靶点的分析

为了检测LFS-829是否能与CRM1疏水槽反应性半胱氨酸残基靶向结合，本研究进行了MALDITOF质谱实验分析。设置了正常CRM1肽段、半胱氨酸位点突变的CRM1肽段、正常CRM1肽段＋小分子LFS-829、半胱氨酸位点突变的CRM1肽段＋小分子LFS-829 4个组别。首先配制含有20 mmol／L Tris-HCl，pH 7.5，100 mmol／L NaCl，50%甲醇的缓冲液，将肽1μg用含有LFS-829 10μg的缓冲液溶解后置于37℃摇床中抚育24 h。配制基质溶液，将乙腈与含有0.1%的三氟乙酸（TFA）水溶液1∶1混合，然后按10 mg／mL加入 α-氰-4-羟基肉桂酸，混匀。将处理后的肽溶液0.5μL与基质溶液0.5μL混合。将混合溶液沉积于不锈钢样品板上，并使溶剂在环境温度下蒸发。用MALDI-TOF质谱仪对各组样品进行检测分析。

2.3 LFS-829对ENKTL细胞增殖活性的影响

将生长状态良好的SNK6及HANK-1细胞，以每孔5 000个细胞的密度接种到96孔板中，等量新鲜培养基作为空白对照，设置适当的药物浓度梯度，分别加到各组细胞中，每个浓度3组平行。培养72 h后，在实验组和对照组每孔加入CCK-8溶液10μL，并于37℃、5%CO2培养箱中避光孵育2 h，在450 nm波长处的测定吸收度。用GraphPad Prism软件分析处理得出IC50［9］。

外周血淋巴细胞毒性测试以及血小板毒性测试中，在按照试剂盒说明分别提取正常人外周血单核淋巴细胞以及血小板后，采用类似的实验方法检测细胞活性，分析LFS-829对正常细胞的毒性作用。

2.4 药物作用下SNK6细胞形态的变化

收集生长状态良好的SNK6细胞，向活细胞工作站配套的四连小室中加入适当密度的细胞悬液，在工作站中沉降10 min。设置实验组和对照组。对照组在常规培养下进行细胞培养，并定时拍照记录，实验组加入含有2μmol／L的LFS-829的培养基，其他条件与对照组相同，并定时拍照记录，与对照组结果进行对比。

2.5 LFS-829对CRM1核输出功能的影响

将生长状态良好的SNK6细胞接种于6孔板中，等待融合度约为80%后向细胞培养基中分别添加 LFS-829至终浓度为 0、200、400、800 nmol／L。并以200 nmol／L的 KPT330作为阳性对照组［10］。收集细胞，滴加置黏附载玻片上，静置30 min；用预冷的PBS漂洗3次；多聚甲醛固定，PBS漂洗；加入Triton 100增加细胞膜的通透性，PBS漂洗；用含有5%BSA的PBS封闭，加入一抗，4℃过夜，PBS漂洗；加入二抗37℃孵育1 h，PBS漂洗；滴加DAPI染液对对细胞核进行染色处理，PBS漂洗3次后封片，在激光共聚焦显微镜下观察。并用Image J软件进行定量分析［11］。

2.6 LFS-829对CRM1、NF-κB信号通路及凋亡通路相关蛋白表达的影响

将生长状态良好的SNK6细胞接种于6孔板中，待融合到达到80%，每孔添加终浓度为0、200、400、800 nmol／L的 LFS-829，继续培养 48 h，收集细胞分别提取细胞总蛋白、细胞核蛋白以及细胞质中的蛋白。经SDS-PAGE电泳，湿法转膜，5%BSA封闭，依次孵育一抗、二抗，洗膜并使用ECL试剂盒进行显影。以β-actin作为内参，分析CRM1、NF-κB信号通路［12-13］及凋亡通路相关蛋白表达量的变化。

2.7 LFS-829对NF-κB转录活性的影响

首先进行细胞转染，将含有荧光素酶报告基因的质粒p-NF-κΒ-luc和含有海肾荧光素酶基因的质粒phRL-TK转入细胞后，设置实验组和对照组，根据试剂盒说明进行双荧光素酶报告基因的检测。

2.8 LFS-829作用下NF-κB通路下游炎症因子的表达

将生长状态良好的SNK6细胞以适当的密度接种到6孔细胞培养板上，待融合度为80%，向培养基中加入相应浓度的LFS-829使终浓度设定为0、200、400、800 nmol／L，每组 3个平行。培养 48 h之后，离心收集细胞培养基上清液，按照酶联免疫吸附实验试剂盒操作说明检测细胞分泌表达的炎症因子含量的变化。

2.9 细胞凋亡检测

将生长状态良好的SNK6细胞接种到6孔细胞培养板中，每孔4 mL培养基含有约2×106个细胞。每孔添加终浓度为 0、200、400、800 nmol／L的LFS-829，在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。收集细胞，按照后续实验步骤对细胞进行固定，依次使用Annexin V以及PI对细胞进行染色，并使用流式细胞仪进行检测分析。

2.10 动物急性毒性实验

检测LFS-829在短期内对动物的急性危害，每日多次以300 mg／kg的剂量对小鼠进行灌胃给药。连续给药，每日观察小鼠的表现并检测小鼠的体质量变化。第14天解剖小鼠，取心、脾、肝以及肾。用10%中性福尔马林固定1周，之后进行脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，观察小鼠脏器的变化。

2.11 统计学方法

本研究采用GraphPad Prism 7.0以及SPSS 17.0统计学软件进行数据处理。所有实验均独立重复3次以上，结果数据以±s表示。组间均数的比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 LFS-829通过CRM1疏水活性口袋的半胱氨酸残基与CRM1共价结合

基于母核结构LFS-01利用分子片段生长的方法进行衍生，得到化合物LFS-06。为了进一步优化，使用SYBYL-X软件中的Legion／CombiLibMake模块生成药效团的组合库，包含45种亚结构对LFS-06的苯环结构进行不同形式的取代，产生了2 025个类似物分子组成了潜在的靶向CRM1蛋白的新型小分子抑制剂数据库。使用 Discovery Studio软件中ADME／T模块从得到的小分子数据库中筛选前100种类似物分子，保证其具有良好的药物特性。随后，采用FIPSDock进行共价对接来预测模拟分子与CRM1的结合。将利用ADME／T打分排名前100的化合物与CRM1进行共价对接，图1-A所示结果预测LFS-829与CRM1的结合强度优于其他的潜在小分子抑制剂。图1-B则展示了LFS-828的异硫氰酸基的C原子与CRM1疏水活性口袋CYS残基的S原子发生了共价结合。通过ligplus平面展示的结果，可以看出LFS-829除了能够与CRM1的NES疏水活性口袋中与CYS残基的S原子发生共价结合外，还与多个的氨基酸残基发生疏水相互作用，其中发挥了主要作用的是以下几种氨基酸:Phe572、Val576、Leu536、Lys579、Glu540、Lys548、Ala552、Ile555和 Phe583。

利用MALDI-TOF质谱技术检测LFS-829是否通过疏水槽反应性半胱氨酸残基与CRM1靶向结合，结果显示在LFS-829与正常肽段共同孵育过夜后，除了出现了正常肽段的离子峰，还出现了CRM1疏水槽正常肽段与小分子LFS-829结合的离子峰，而在与CRM1疏水槽突变肽段共孵育的结果，只出现了CRM1疏水槽突变肽段的离子峰却没有出现其与小分子LFS-829结合的离子峰。结果说明，LFS-829是通过与CRM1肽段上的CYS残基结合而靶向CRM1的。

3.2 LFS-829选择性杀伤ENKTL细胞 具有良好的安全性

实验结果显示，在用不同浓度的LFS-829处理细胞72 h后，SNK-6和HANK-1两种淋巴瘤细胞的增殖活性都受到了明显抑制，72 h的半数抑制浓度分别为366和158 nmol／L。活细胞工作站实验结果（图2-C）可以观察到，LFS-829作用于细胞后，细胞的形态逐渐发生变化。在药物作用60 min后出现了细胞破损现象，随后破碎细胞逐渐增多，在药物作用180 min后肿瘤细胞基本都破碎变成细胞碎片，而对照组中细胞的形态在整个观察过程中都无明显变化。为了进一步研究LFS-829对ENKTL细胞的选择性，本研究评估了LFS-829在从健康献血者外周血中分离出的PBMC以及血小板的毒性，如图2-B所示。结果LFS-829在16μmol／L浓度下对正常PBMC几乎没有任何毒性，即使在非常高的剂量（40μmol／L）情况下，对正常PBMC也只有很小的毒性。在对于血小板的毒性测试中，LFS-829也显示明显的对ENKTL细胞杀伤的选择性。另外小鼠急毒实验结果如图2-D所示，使用300 mg／kg的大剂量在24 h内多次给小鼠灌胃，小鼠脏器的HE染色的组织切片未发现小鼠组织形态发生明显变化，即在超大剂量的作用下，LFS-829未对小鼠造成实质性的组织损伤，说明通过中药天然产物有效成分改造得到的LFS-829具有良好的安全性和应用前景。

3.3 LFS-829通过抑制CRM1蛋白活性下调NF-κB信号通路

证实小分子LFS-829能够通过与CRM1疏水槽反应性半胱氨酸残基结合而靶向CRM1，并且能够选择性杀伤ENKTL细胞后，本研究继续探究其中的作用机制。利用免疫荧光法检测LFS-829对CRM1介导的IκB-α核输出过程的影响。结果如图3-A所示，在对照组中，IκB-α蛋白的绿色荧光主要分布在细胞质中。用LFS-829处理SNK-6细胞后，绿色荧光的强度开始逐渐增强，并且以剂量依赖性从细胞质定位到细胞核中。

LFS-829能够对肿瘤细胞中异常的CRM1介导的 IκB-α核输出产生抑制作用，恢复 IκB-α的核定位。如图4所示，蛋白印迹实验结果表明，LFS-829不仅能够抑制CRM1的蛋白活性还能够显著降低CRM1蛋白的表达量，进而引起IκB-α的核聚集，这一结果与免疫荧光的结果一致。研究表明NF-κB的转录活性与其磷酸化水平密切相关，实验结果显示在LFS-829的作用下，细胞核内被激活的NF-κB转录因子和异常活化的NF-κB信号通路被抑制，NF-κB的表达量及其磷酸水化平均被下调，其下游的如Bcl-XL、Cox-2、survivin的表达量显著降低，与其相关的炎症因子的表达量也随LFS-829浓度的增加而减少。

3.4 LFS-829可以激活细胞凋亡通路，促使SNK6细胞发生凋亡

有研究表明，NF-κB通路的激活能够增强细胞的抗凋亡能力，前面的实验结果表明LFS-829能够抑制NF-κB信号通路，接下来本研究将探究LFS-829对结外NK／T细胞淋巴瘤细胞凋亡的影响。利用流式细胞仪对在药物作用下的细胞凋亡进行检测，结果表明，随着药物浓度的增加，活细胞的比例不断减少，早期及晚期凋亡的细胞均逐渐增加，尤其是晚期凋亡变化更为明显，结果表明LFS-829能够诱导SNK6细胞发生凋亡。

Figure 1 Targeted binding of LFS-829 to chromosome maintenance protein 1（CRM1）A:Covalent docking heat map of 100 potential small molecule inhibitors with CRM1；B:Covalent docking structure of LFS-829 and CRM1；C:Ligplus plane display of LFS-829 binding to CRM1；D:LFS-829 and CRM1 normal peptide interaction mass spectrometry results；E:LFS-829 and CRM1 mutant peptides interaction mass spectrometry results

Figure 2 LFS-829 selectively killed extranodal natural killer／T cell lymphoma（ENKTL）cells（x¯±s，n＝3）A:LFS-829 inhibits the proliferation of SNK6 and HANK-1；B:Effect of high concentration of LFS-829 on PBMCactivity；C:Effect of LFS-829 on the morphology of SNK6 cells；D:Tissue section results of animal acute toxicity test in mice；E:Effect of LFS-829 on platelet activity**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.000 1

Figure 3 LFS-829 inhibitsed nuclear export of IκB-αprotein in SNK6 cellsA:Laser confocal display demonstrates nuclear export inhibition of IκB-αprotein；B:Statistical analysis（±s，n＝5）***P＜0.001

为了进一步了解LFS-829引起SNK6细胞凋亡是否与凋亡通路蛋白的激活相关，利用蛋白印迹实验检测了凋亡相关蛋白剪切型Caspase 3、剪切型Caspase 9以及p53蛋白的表达。结果如图5所示，随着药物浓度逐渐增加，p53的表达量不断增加，剪切型Caspase 3以及剪切型Caspase 9被激活，进而激活了细胞的凋亡信号通路，促使SNK6细胞凋亡。

4 讨 论

核输出蛋白CRM1在肿瘤发展和免疫疾病发病机制发挥着重要作用，研究表明CRM1在多种肿瘤类型中均有显著上调，尤其是液体肿瘤包括淋巴瘤、白血病以及骨髓瘤。本研究首先对实验室前期筛选得到的天然活性成分LFS-01进行改造，设计得到新型CRM1小分子抑制剂LFS-829。并证实LFS-829对CRM1的靶向作用。

本研究发现，LFS-829能够靶向CRM1下调结外NK／T细胞淋巴瘤的NF-κB信号通路，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖活性。实验结果发现LFS-829在抑制CRM1活性的同时，CRM1的表达量也显著下调，说明LFS-829可能具有其他的作用靶点抑制了CRM1的表达或者加强了它的降解，其中的作用机制需要更深入的探究。另外CRM1能够介导多种调控因子，如肿瘤抑制蛋白、周期相关蛋白、凋亡相关蛋白等蛋白的核输出过程。可以通过转录组以及蛋白质组的更全面而深入的分析LFS-829抑制肿瘤细胞增殖生长的作用机制。

综上所述，本研究设计得到了新型CRM1靶向抑制剂LFS-829，在ENKTL中能够靶向 CRM1，促使IκB-α发生细胞核聚集，进而抑制 NF-κB的转录活性，下调其下游蛋白的表达，抑制相关炎症因子的分泌，减缓炎症反应，同时激活凋亡通路，促使肿瘤细胞发生凋亡，选择性杀伤结外NK／T细胞淋巴瘤且具有良好的安全性，为ENKTL的靶向治疗提供了很有应用前景的研究方向。