微滴数字PCR技术动态监测非小细胞肺癌患者血浆游离DNA EGFR基因突变研究

郑晓彬 庄武 黄韵坚 林根 吴标 蒋侃 林金兰 黄章洲

【摘要】 目的：探討微滴数字PCR技术（ddPCR）动态监测非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆游离DNA表皮生长因子受体（EGFR）基因突变的临床价值。方法：选取2017年3月-2019年3月就诊于笔者所在医院的120例NSCLC患者，均行突变扩增系统（ARMS）、ddPCR检测血浆EGFR标本。以肿瘤组织ARMS检查结果为金标准，分析血浆ARMS、ddPCR检测EGFR基因突变的敏感性和特异性。结果：120例患者经ARMS检测到肿瘤组织标本中EGFR基因突变阴性59例（49.17%）;EGFR基因突变阳性61例（50.83%），其中Exon20 T790M突变2例，含Exon19del突变32例，含Exon21L858R突变26例，合并Exon20T790M突变1例;血浆ARMS、ddPCR检测EGFR基因和含Exon19del、Exon21L858R基因突变的特异性均为100%，检测EGFR基因和含Exon19del、Exon21L858R基因突变敏感性分别为57.38%（35/61）、80.33%（49/61），62.50%（20/32）、84.38%（27/32），46.15%（12/26）、76.92%（20/26），差异有统计学意义（P<0.05）。结论：ddPCR动态监测NSCLC患者血浆EGFR基因突变的敏感性与特异性较高，并能够定性EGFR基因突变类型，能为临床治疗提供指导。

【关键词】 非小细胞肺癌 游离DNA表皮生长因子受体 微滴数字PCR技术

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.03.028 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2020）03-00-03

[Abstract] Objective： To investigate the clinical value of micro-drop digital PCR （ddPCR） in the dynamic monitoring of plasma free DNA epidermal growth factor receptor （EGFR） gene mutation in patients with non-small cell lung cancer （NSCLC）. Method： A total of 120 patients with NSCLC who were admitted to our hospital from March 2017 to March 2019 were enrolled in the study. All patients underwent mutation amplification system （ARMS） and ddPCR to detect plasma EGFR samples. The sensitivity and specificity of EGFR gene mutation were detected by plasma ARMS and ddPCR using the results of AMS examination of tumor tissue as the gold standard. Result： A total of 59 patients （49.17%） with negative EGFR gene mutations were detected by ARMS in the 120 patients. 61 cases were positive for EGFR gene mutation （50.83%）， including 2 cases of Exon20 T790M mutation， including 32 cases of Exon19del mutation， including Exon21L858R mutation 26 cases， 1 case of Exon20T790M mutation was combined. The specificity of EGFR gene and Exon19del and Exon21L858R gene mutations in plasma ARMS and ddPCR were 100%， and the mutation sensitivity of EGFR gene and Exon19del and Exon21L858R gene were 57.38% （35/ 61）， 80.33% （49/61）， 62.50% （20/32）， 84.38% （27/32）， 46.15% （12/26）， 76.92% （20/26） respectively， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： The ddPCR can dynamically monitor the sensitivity and specificity of plasma EGFR gene mutation in patients with NSCLC， and can identify the type of EGFR gene mutation， which can provide guidance for clinical treatment.

[Key words] Non-small cell lung cancer Free DNA epidermal growth factor receptor Microdroplet digital PCR

First-authors address： Fujian Provincial Cancer Hospital Affiliated to Fujian Medical University， Fuzhou 350014， China

非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌常见类型之一，发病率约占肺癌的80%，其中60%～70%患者就诊时已发展为中晚期，此时给予手术治疗，难以达到理想的治疗效果[1-2]。以游离DNA表皮生长因子受体（EGFR）基因为代表性靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI）是临床治疗NSCLC的靶向之一[3]。EGFR-TKI治疗疗效取决于EGFR基因突变。故选择适宜的检测方式筛选出EGFR基因突变及其类型，指导临床治疗，对改善患者预后尤为重要。因多数晚期NSCLC患者在疾病进展或初治后无法获得组织标本检测基因，限制患者从靶向治疗获益。有研究指出，可将外周血作为检测EGFR基因突变的标本[4]。虽然液体活检具有可重复检测、方便易取等优点，但因血浆循环肿瘤脱氧核糖核酸（ctDNA）浓度低、片段化严重、检测手段欠标准化等不足，存在一定的争议。本研究选取2017年3月-2019年3月就诊于笔者所在医院的120例NSCLC患者，均行突变扩增系统（ARMS）、ddPCR检测血浆EGFR标本，以肿瘤组织ARMS检查结果为金标准，分析两者检测价值，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年3月-2019年3月就诊于笔者所在医院的120例NSCLC患者，男58例，女62例;年龄31～79岁，平均（63.21±2.33）岁。纳入标准：年龄≥18周岁;病理组织确诊为NSCLC;骨髓功能、血常规、心电图基本正常;首次治疗。排除标准：精神疾患;造血功能严重障碍;哺乳期或妊娠期女性;肝肾功能严重障碍。患者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集和DNA检测 采集入组患者10 ml空腹静脉血，行10 min的1 600 r/min离心操作，获取上清液，再行10 min的16 000 r/min离心操作，收集血浆。按照循环DNA核酸提取试剂盒说明书提取DNA。使用美国Invitrogen公司的Qubit2荧光定量仪和安捷伦科技公司Agilent 2100生物分析仪对DNA片段大小和浓度进行分析。DNA片段約为170 bp，浓度>20 ng/μl为合格。

1.2.2 ARMS检测 使用美国ABI公司的7500荧光定量PCR仪和人类EGFR基因突变检测试剂盒（厦门艾德公司，批号01217081601X）检测EGFR基因突变。严格按照试剂盒操作和结果判读。

1.2.3 ddPCR 在含有相应探针的ddPCR超级混合液中加入DNA样本，充分混合、离心后，置入20 ml的ddPCR反应液体系中，其含有模板、探针和引物等，在QX200 dd PCR系统中反应样本。反应条件设置：扩增30个循环，95 ℃孵育5 min，72 ℃延伸7 min后结束，降至4 ℃。结果使用Quantasoft软件分析。>2个突变微滴数为阳性界值。

1.3 观察指标

以肿瘤组织ARMS检查结果为金标准，分析ARMS、ddPCR检测EGFR基因突变的敏感性和特异性。以n表示总例数，a表示真阳性，b表示假阳性，c表示假阴性，d表示真阴性。敏感性=a/（a+c），特异性=d/（b+d）。

1.4 统计学处理

用SPSS 21.0软件分析数据，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 以肿瘤组织ARMS检查结果

120例患者经ARMS检测到肿瘤组织标本中EGFR基因突变阴性59例（49.17%）;EGFR基因突变阳性61例（50.83%），其中Exon20 T790M突变2例，含Exon19del突变32例，含Exon21L858R突变26例，合并Exon20T790M突变1例。

2.2 ARMS、ddPCR检测EGFR基因突变的敏感性和特异性

ARMS、ddPCR检测EGFR基因突变的特异性均为100%（59/59），敏感性分别为57.38%（35/61）、80.33%（49/61），差异有统计学意义（字2=7.491，P=0.006），见表1、表2。

2.3 ARMS、ddPCR检测Exon19del突变特异性和敏感性

ARMS、ddPCR检测Exon19del基因突变的特异性均为100.00%（59/59），敏感性分别为62.50%（20/32）、84.38%（27/32），差异有统计学意义（字2=3.925，P=0.048），见表3、表4。

2.4 ARMS、ddPCR检测Exon21L858R突变特异性和敏感性

ARMS、ddPCR检测Exon21L858R基因突变的特异性均为100%（59/59），敏感性分别为46.15%（12/26）、76.92%（20/26），差异有统计学意义（字2=5.200，P=0.023），见表5、表6。

3 讨论

肺癌是目前死亡率较高的恶性肿瘤，其中NSCLC较为常见。EGFR-TKI阿法替尼、厄洛替尼、吉非替尼等治疗存在EGFR基因突变的晚期NSCLC效果显著。但初始对EGFR-TKI反应良好的患者几乎均会在6～12个月内出现疾病进展、耐药等不良情况[5]。相关研究显示，肿瘤对EGFR-TKI反应取决于EGFR基因突变状态[6]。因此，早期准确鉴别诊断EGFR基因突变状态，并持续监测其变化状态，及时发现耐药、基因突变以改变治疗策略，对针对性EGFR-TKI治疗和预后预测至关重要。

细胞学标本或肿瘤病理组织标本是检测EGFR基因突变的最常用来源，因肿瘤组织标本难以获取，同时操作易受到肿瘤部位、大小及患者一般情况等影响，有时组织量太少或无法获得满意的组织标本实施基因突变检测，且组织取材为有创操作，无法反复、便捷实施[7-8]。使用液体活检技术取代组织活检逐渐成为研究的热点。ctDNA用于肿瘤突变检测具有操作无创等优势，可作为肿瘤标记物，实时检测、动态监测，对治疗策略的改变提供指导;可在疾病任一进程中获取，且能够克服肿瘤组织的异质性。但检测结果会因检测技术不同存在一定差异，难以满足临床需要[9-10]。因而寻求一种检测和判断简单且敏感度、高特异度的技术尤为重要。本研究结果显示，ARMS、ddPCR检测EGFR基因突变和Exon19del、Exon21L858R突变的特异性均为100%，检测EGFR基因和含Exon19del、Exon21L858R基因突变敏感性分别为57.38%、80.33%，62.50%、80.77%，46.15%、76.92%，提示ddPCR检测EGFR基因突变价值更高。ddPCR是经微滴发生器对样本实施微小滴化处理，制作成体积约为2×104个1 ml的微滴后实施PCR反应，随后使用微滴检测器逐个检测每个微滴，能准确检测出不含有目标分值的微滴数和含有目标分值的微滴数，根据两者比例，计算出目标DNA分值的浓度，进而实现绝对定量[11-12]。微滴式数字PCR经微滴化处理，能从大量的非目标DNA或杂质中分离出目标片段，在单个微滴中独立实施PCR反应，能使检测敏感性提高。ddPCR使用现有的仪器便能完成检测，操作简单，且能绝对定量分析核酸，进而直接读数判断结果。本研究仍存在一定的不足之处，如纳入样本量较少，未对分析各方式诊断Exon20T790M突变、合并Exon20T790M突变的敏感性与特异性等，后期仍需深入研究。

综上所述，ddPCR动态监测NSCLC患者血浆EGFR基因突变的敏感性与特异性较高，并能定性EGFR基因突变类型，能为临床治疗提供指导。

参考文献

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（收稿日期：2019-12-09） （本文编辑：张亮亮）