培养管硅胶显色法直接检测结核菌吡嗪酰胺耐药性

瞿梅 黄飞 陈俊林 顾德林 胡忠义 丁元生

【摘要】 目的：利用培养管硅胶显色法直接检测临床涂阳痰标本中结核分枝杆菌（MTB）吡嗪酰胺（PZA）药物敏感性，并对该方法进行临床应用评价。方法：对2016年6月-2017年10月在南通市第六人民医院就诊的158例肺结核患者涂阳痰标本进行预处理，利用Bactec MGIT960与培养管硅胶显色法同步进行PZA药物敏感性检测，并对检测结果进行比较。结果：以Bactec MGIT960检测PZA药物敏感性结果为判断标准，培养管硅胶显色法灵敏度、特异性、符合率分别为96.8%、95.9%、96.7%。报告结果平均时间为（24.5±2.0）d，同Bactec MGIT960检测时间相仿，报告时间与痰中MTB菌量及活力有相关性。结论：培养管硅胶显色法可以替代Bactec MGIT960直接对临床涂阳痰标本进行PZA药物敏感性检测，结果可靠，操作简便，成本低廉，满足临床快速诊断的需要，适合推广使用。

【关键词】 结核分枝杆菌 吡嗪酰胺 药物敏感性试验 硅胶显色法 Bactec MGIT960

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.03.026 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2020）03-00-04

[Abstract] Objective： Using Culture tube silica gel assay to directly detect Pyrazinamide （PZA） drug sensitivity of mycobacterium tuberculosis （MTB） in clinical specimens of sputum smear-positive， and to evaluate clinical application of this method. Method： A total of 158 cases sputum smear-positive samples of pulmonary tuberculosis patients from June 2016 to October 2017 in Nantong Sixth Peoples Hospital were pretreatmented， PZA drug sensitivity test were synchronous detected by Bactec MGIT960 and culture tube silica gel assay， and the test results were compared. Result： The results of PZA drug sensitivity by Bactec MGIT960 as the judgment standard， sensitivity， specificity and accuracy of culture tube silica gel assay were 96.8%， 95.9% and 96.7% respectively. The average time of report results was for （24.5±2.0） d， similar with Bactec MGIT960 testing time， report time were correlationsand with the number of MTB in sputum and dynamic. Conclusion： The culture tube silica gel assay can replace Bactec MGIT960 for directly detecting PZA resistance of MTB in smear-positive sputum， the result is reliable， simple operation， low cost. It can meet the need of rapid clinical diagnosis and worthy in application.

[Key words] Mycobacteriurn tuberculosis Pyrazinamide Drug susceptibility Culture tube silica gel assay Bactec MGIT960

First-authors address： Nantong Sixth Peoples Hospital， Nantong 226011， China

随着医学科学进步，结核病精准化治疗已成为医患双方共同追求的目标，作为特异感染性疾病，为避免无效用药，快速精准诊断患者感染的结核菌是否出现耐药是制定有效治疗方案的关键。相对于其他一线抗结核药物能高效利用高分辨率熔解曲线、基因芯片等分子生物技术或者微量MIC、MODS等表型药敏技术来进行快速药敏鉴定[1-3]，吡嗪酰胺（PZA）目前已知并被常用来检测的耐药基因pncA.很难覆盖所有的基因突变位点[4-6]，因其独特的杀菌条件要求被国外推荐最有效的表型药敏检查方法BACTC MGIT960[7-8]，因仪器和试剂价格昂贵而很难在国内推廣应用。本课题组充分利用现有MTB表型药敏检测技术并结合一些特殊新材料，设计生产了一种可视化MTB药敏检测新型产品—底部包含有适量变色硅胶的微孔板和培养管（微孔板和培养管仅存在培养载体差别，技术特征及设计性能完全一致），已在前期利用微孔板测试了MTB临床分离株的PZA药物敏感性，确定液体培养基最佳pH值在5.7～5.9、最佳接种菌量为0.25 mg/ml、MIC最佳判断界值为200 μg/ml、7～14 d即可报告结果并制定了相应的检测流程[9]，本课题组就再次利用含有变色硅胶的培养管直接对临床涂阳痰标本进行PZA药物敏感性测试，结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 菌株来源 牛分枝杆菌菌株和MTB标准菌株均采购自中国微生物菌种保藏中心，痰标本来自于2016年6月-2017年10月在南通市第六人民医院结核科就诊的158例涂阳肺结核患者。肺结核痰涂片抗酸杆菌阳性分级计数：以1+、2+、3+、4+记录[10]。其中22例1+，23例2+，58例3+，55例4+。

1.1.2 试剂与仪器设备 PZA、对硝基苯甲酸（PNB）购自美国Sigma公司;Middlebrook7H9培养基干粉、61010A-1型比浊仪、BD培养液、Bactec MGIT960检测仪购自美国BD公司;隔水式培养箱购自上海精宏实验设备有限公司;变色硅胶培养管，由上海积彩医疗器械有限公司提供。

1.1.3 试剂配制 液体培养基（pH 5.8）配制参见文献[11]，PZA先用去离子水溶解，再用配制的液体培养基进行稀释，最终浓度设为200 μg/ml;PNB用配制的液体培养基稀释，最终浓度为800 μg/ml。MIC最佳判断界值为200 μg/ml。

1.2 方法

1.2.1 标本处理 先取合格痰标本1 ml置于试管内，再加入4%NaOH液4 ml，进行充分振荡后移入37 ℃水浴箱内，15 min后取出试管用1 mmol/L的磷酸盐缓冲液进行中和，离心后再次移入37 ℃水浴箱内。

1.2.2 培养管硅胶显色法检测涂阳标本PZA敏感性 参考文献[9]设定测试管、阴性对照管、阳性对照管、PNB含药管，测试管中加入0.4 ml终浓度为200μg/ml含PZA培养基，再接种标本处理液0.4 ml;阴性对照管加不含药7H9液体培养基0.8 ml、不接种MTB菌液，作为阴性控制;阳性对照管加不含药7H9液体培养基0.4 ml、接种MTB菌液0.4 ml。将培养管加盖后置于37 ℃温箱内进行培养，每天观察培养管底硅胶颜色变化来判断该测试孔内MTB是否对RFP耐药。判断方法参考文献[12-13]，若对照管内底硅胶由天蓝色变为黄色，PNB含药管底硅胶尚未变色，则说明该标本中分枝杆菌为MTB;若对照管内底硅胶由天蓝色变为黄色，PNB含药管底硅胶由天蓝色变为黄色，则说明标本中分枝杆菌为非结核分枝杆菌（NTM）。当阳性对照管底硅胶由天蓝色变为黄色，测试管底硅胶尚未变色，说明测试管MTB生长被药物抑制，判为敏感;而当测试管先于对照管或与对照管同时见管底硅胶颜色发生改变，说明药物不能抑制测试管MTB繁殖，判断该测试管内MTB对PZA耐受。

结果判断：观察为5～50 d，超过50 d不生长需重复试验。质量控制：每次试验均以牛分枝杆菌为耐药株质控，H37Rv为敏感株质控。

1.2.3 BACTEC MGIT960检测PZA药物敏感性 按照文献[14]及BACTEC MGIT960 操作说明，吸取标本处理液0.5 ml加入到 MGIT960液体培养管中，培养7～10 d后选取阳性培养管，吸取1 ml阳性培养液至4 ml无菌生理盐水中作为稀释菌液，再以此稀释菌液按照1∶100进行稀释作为对照，吸取500 μl稀释菌液加有PZA的药物培养管中颠倒混匀（培养基的药物浓度为200 μg/mL），吸取500 μl稀释菌液对照管中颠倒混匀，标记后分别置入BACTEC MGIT960培养箱，仪器会在若干天之内会自动报告检测结果。质量控制：每次药敏试验均采用H37Rv标准株作为阳性参照。

1.3 统计学处理

使用SPSS 13.0统计软件作为分析工具，计数资料以率（%）表示，采用字2检验，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 培养管硅胶显色法与Bactec MGIT960检测158例涂阳痰标本PZA药敏结果

培养管硅胶显色法检测结果：鉴定为NTM 2例，鉴定为MTB 153例，培养阴性3例;敏感MTB 126例，耐药MTB 27例。Bactec MGIT960检测结果：鉴定为NTM 2例，鉴定为MTB 153例，培养阴性3例;敏感MTB 129例，耐药MTB 24例。以Bactec MGIT960检测结果为标准：培养管硅胶显色法与Bactec MGIT960检测方法结果相符合148例，不符合5例，符合率为96.7%（148/153）;培养管硅胶显色法敏感度为96.9%（125/129），特异度为95.8%（23/24），见表1。

2.2 培养管硅胶显色法与Bactec MGIT960檢测痰标本PZA药敏时间

从处理后的标本加入培养管开始计时，Bactec MGIT960药敏报告时间为15～40 d，平均（23.3±2.0）d。培养管硅胶显色法检测时间16～44 d，平均（24.5±2.0）d。将两者最终药敏结果所需时间对比，培养管硅胶显色法药敏报告时间稍长于Bactec MGIT960药敏报告时间，但差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

3 讨论

现阶段耐药结核病特别是耐多药结核病的流行已成为严重困扰中国公共卫生的大问题[15-16]，而PZA是被用来控制耐药结核病的重要药物。因PZA药物敏感性试验要求非常高，因此国内很少有机构开展PZA药敏试验。为解决这一难题，本研究团队设计制造出一种含变色硅胶的微孔板和培养管来尝试检测MTB对PZA药物敏感性。设计原理及方法为：利用硅橡胶具有良好的二氧化碳吸附性能和固载酸碱指示剂离子能力[17-18]，将筛选的酸碱指示剂通过特殊工艺负载于硅胶固化，将适量的固载指示剂离子的变色硅胶通过特殊工艺附着在透明的微孔板或培养管底部。如果接种在微孔板患者培养管内液体培养基中的标本内有活的MTB存在，其生长代谢过程中会释放二氧化碳（CO2）并通过透气材料层和固载在硅胶内酸碱指示剂发生反应而出现硅胶颜色变化，间接监测、报告MTB生长代谢状况，肉眼就能观察结果。同时硅胶良好疏水性阻止水性溶液中的H+、OH-自由进出，故培养基液体pH值对固载在硅橡胶内酸碱指示剂无影响，完美地解决了一些可视化微量液体MTB药敏检测方法中将颜料或者指示剂直接加入培养基中、可能改变培养基的pH值而影响MTB生长最终导致药敏结果判断错误[19]。

本研究團队已利用装置了变色硅胶的微孔板和培养管在前期测试了MTB临床分离株对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素等抗结核药物敏感性试验，证明新产品可靠性能[13，20];也测试MTB临床分离株的PZA药物敏感性，并确定了最佳检测条件和检测时间。MTB临床分离株是实验室将含菌标本培养分离筛选出的优势菌群、生长繁殖能力强，用于PZA药物检测容易定量且能较快得药敏结果，但MTB临床分离菌株获取过程耗时较长难以满足临床需要。本试验组根据前期利用微孔板变色硅胶显色法对MTB临床分离株PZA药敏试验获得的数据，利用培养管变色硅胶显色法直接对临床涂阳痰标本中MTB进行PZA药敏检测，实验结果提示：（1）最好选择近期未接受抗结核药物治疗且分级计数3+以上痰标本，因为3+以上痰标本经过适当处理可达到或接近10-3 mg/ml检测终浓度[21]，虽然达不到0.25 mg/ml最佳检测要求，但基本可以用来进行直接测试。而分级计数在2+以上痰标本或已接受抗结核治疗半月以上的痰标本，MTB活菌减少或者MTB活力减弱，药敏结果报告时间会相对延长，如果用来直接进行PZA药物敏感性检测，最好采用集菌方法。（2）在MIC为200 μg/ml判断界值下，利用培养管色硅胶显色法所检测获得药敏结果与Bactec MGIT960基本一致，较真实反映临床痰标本中MTB的PZA药物敏感性。（3）治疗后痰标本中MTB菌群状态较为复杂，因为活性下降或活菌数理较少，培养时间会相应延长，硅胶颜色改变缓慢且不明显，肉眼判断较困难，可借助辨光检测仪来观察对照管和检测管硅胶颜色变化，对颜色的细微变化做出分辨，有条件可以考虑联合基因检测技术进行pncA耐药基因检测来提高检出率[22]。（4）因为PZA这种仅能杀灭巨噬细胞内结核分枝杆菌MTB的抗结核药物，需要pH 5.7～5.9的酸性环境下才能发挥其最强杀菌能力[23]，而同样条件下结核分枝杆菌MTB繁殖非常缓慢，因此培养基的调配要求相应较高，本研究所用液体培养基成分与Bactec MGIT960培养基成分相似，保证了MTB在酸性培养基繁殖能力最优化。（5）利用变色硅胶培养管对158例临床涂阳痰标本进行分枝杆菌菌型鉴定，结果鉴定与Bactec MGIT960完全一致，证明变色硅胶培养管在分枝杆菌培养及鉴定方面性能可靠。

本课题组利用变色硅胶培养管这一新型可视化MTB表型药敏检测工具直接检测涂阳痰标本中MTB对PZA药物敏感性，是为了提高检测效率、根据结核病临床快速药敏试验需要进行的研究，但在实际检测过程中发现极少数痰标本中MTB药敏检测结果与Bactec MGIT960不一致，需要扩大样本量进行系统研究分析差异原因，可能需要在变色硅胶的指示剂离子负载量、硅胶孔径分布等方面进一步修正完善。变色硅胶培养管检测技术原理科学、制作成本低，检测结果易判读且快速、精准，适合结核病实验室推广应用。

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（收稿日期：2019-09-12） （本文编辑：张亮亮）