复合益生菌乳膏剂的制备和对断奶仔猪生长性能的影响

魏秀莲，张 乐，娄迎霞，吴长金，曹 林，张 静，陈小全，刘雪连

（1.北京市饲料监察所，北京 100107；2.饲用微生物工程国家重点实验室，北京 100192；3.浙江大北农农牧科技有限公司，浙江 321016；4.哈尔滨大北农牧业科技有限公司，黑龙江 哈尔滨 150431）

1 简介

畜禽养殖中抗生素的滥用导致严重的细菌耐药性，世界各国陆续禁止抗生素作为促生长添加剂的使用。近年来，生猪生产中，已广泛使用益生菌来替代抗生素，提高猪的生产性能[1]。使用益生菌可改善猪只肠道菌群结构、抑制有害菌定殖，预防猪只消化道疾病[2]。

已有多项研究探讨单一菌株对断奶仔猪生产性能的影响，包括约氏杆菌和干酪乳杆菌等[3-4]。当前，人们对于益生菌饲料添加剂的研究正从单一菌株向复合菌株转变[5-6]。因此，根据哺乳仔猪阶段营养物质的需求，基于前期工作基础，选择了干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）， 屎 肠 球 菌（Enterococcus faecium），植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）组合成不同配方，将其添加到乳膏剂基质中，制备了4种复合益生菌乳膏剂，测试其在常温下的保存稳定性，并将优化配方作为饲料添加剂添加到断奶仔猪日粮中，评估其对断奶仔猪生长性能的影响，包括平均日增重、平均日采食量、饲料增重比和末均重，以及腹泻率。

2 材料和方法

2.1 复合益生菌乳膏剂的制备

参考北京大北农科技集团股份有限公司企业标准《哺乳仔猪用0.2%复合预混合饲料（源生态软酪乳乳膏剂）》（Q/HDDBN0077-2019）制备乳膏剂基质。以1 000 g乳膏剂基质为例，将浓缩低蛋白乳清粉（430 g）、玉米淀粉（210 g）、蔗糖脂肪酸酯（20 g）、黄原胶（2 g）、壳寡糖（0.5 g）和去离子水混合均匀（338 g），70 ℃巴氏灭菌30 min，使用乳化机以10 000 r/min高速乳化10 min。

将干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），屎肠球菌（Enterococcus faecium），植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii） 4 株菌进行组合，确定如下4个配方，配方1：干酪乳杆菌+屎肠球菌+约氏乳杆菌；配方2：干酪乳杆菌+屎肠球菌+植物乳杆菌；配方3：干酪乳杆菌+屎肠球菌；配方4：干酪乳杆菌+屎肠球菌+植物乳杆菌+约氏乳杆菌。将菌粉组合配制，加入到乳化好的乳膏剂基质中，初始活菌数约为109CFU/g乳膏剂。

2.2 复合益生菌乳膏剂的稳定性评估

将所制备的4种配方的复合益生菌乳膏剂，在室温下储存56 d，在 0、7、14、21、28、35、42、49和56 d分别进行活菌计数。具体方法为：取乳膏剂样品10 g，加入无菌玻璃珠10～15颗，无菌水100 mL，室温下180 r/min震荡混匀10 min，梯度稀释至10-6、10-7、10-8和10-94个浓度，取稀释液1 mL接种于MRS培养基中，涂布计数，每个浓度做3个平行。同时使用pH计测定乳膏剂的pH（梅特勒-托利多，FE20）。

2.3 复合益生菌对断奶仔猪生长性能的影响

2.3.1 动物选择与试验设计

从母猪胎次一致、产期相同的20窝中选取体重相似、健康状况良好的14日龄杜h长h大三元杂健康断奶仔猪80头，按照窝别和体重随机分成2个组（复合菌乳膏剂组、对照组），每个组4个重复，每个重复10头猪，试验进行28 d。试验日粮参照NRC（2012）体重5～7 kg仔猪营养需要饲喂基础日粮，复合菌乳膏剂组每头猪添加2 g乳膏剂，对照组仅饲喂基础日粮。

2.3.2 饲养管理

试验猪饲养于玉田猪场温控仔猪舍中，早、中、晚各加一次料，观察各栏仔猪采食量，保证不同采食量的仔猪都能完全自由采食和饮水。

2.3.3 指标测定

1）平均日增重（Average daily gain，ADG）。试验猪在试验开始、第15天、第29天时，早晨8：00空腹称重（前一天20：00断料），ADG（kg）=[末栏重（kg）-始栏重（kg）] / [每栏仔猪头数h 饲养天数（d）]。

2）日采食量（Average Daily Feed Intake，ADFI）。以栏为单位记录每天的投料量与剩料量，求出试验期间每栏总的投料量与剩料量，ADFI（kg）=[投料量（kg）-剩料量（kg）] / [每栏仔猪头数h 饲养天数（d）]。

3）饲料转化率（增重比）（Feed to Gain Ratio，F/G）。F/G=ADFI（kg）/ADG（kg）。

4）腹泻率（Diarrhea Rate，DR）：每天记录每个重复中腹泻的猪只数，求出该重复的总腹泻头次数，将其除以该重复的总饲养头次数，即得出该重复的腹泻率。最后算出该处理各重复腹泻率的平均值。腹泻的标准是，粪便不形成稳定固体，仔猪有明显的稀便肛尾粘着现象。DR（%） = [每栏总腹泻头日次数/（每栏仔猪头数h 饲养天数（d））]h100%。

2.4 数据统计分析

数据用平均值f标准偏差的方式表示。采用SAS 8.0程序GLM过程进行统计分析，两组间比较用t检验（Student's t test），多重比较用邓肯法（Duncan test），以P＜0.05为显著水平。

3 结果

3.1 复合益生菌乳膏剂的稳定性

所制备的4种配方的复合益生菌乳膏剂基质相同，所含菌株种类不同，在室温下的贮藏稳定性见图1。由图1A可见，由干酪乳杆菌、屎肠球菌和约氏乳杆菌组合制备的配方1稳定性最好，在室温下储存56 d仍能维持较高的活菌数（＞108cfu/g），而其他配方的活菌数在28 d后开始迅速下降。图1B为乳膏剂的pH变化，配方1的pH在最初的7 d内下降，随后保持不变，在56 d的保存期中，4个配方乳膏剂的pH均有所下降，其中配方1的pH变化相对较少。因此，选取配方1复合益生菌乳膏剂用于后续仔猪生长性能评估。

3.2 复合益生菌乳膏剂对断奶仔猪生长性能的影响

日粮中添加复合益生菌乳膏剂组中，早期断奶仔猪末均重为(18.22f0.67)kg/头，显著高于对照组的(17.12f0.64)kg/头（P=0.026）。复合益生菌乳膏剂组所得的平均日增重ADG为(485f30)g/头，显著高于对照组的 (432f28)g/头（P=0.019）。2组间平均日采食量ADFI没有显著差异（P＞0.05）。计算所得的复合益生菌乳膏剂组和对照组的饲料增重比F/G分别为1.48f0.08和1.69f0.13，饲喂复合益生菌乳膏剂组的饲料增重比低于对照组，结果具有显著性（P=0.004）。饲喂复合益生菌乳膏剂组和对照组的腹泻率DR分别为1.09 %和0.69 %。在试验过程中，饲喂复合益生菌乳膏剂组出现了黄色的不成型的粪便，相对比较黏稠，一定程度上干扰腹泻情况的判断。

图1 4种配方复合益生菌乳膏剂在常温下储存0～56 d时的活菌数（A）和pH（B）。

表1 复合益生菌乳膏剂对早期断奶仔猪生产性能的影响

4 讨论

早期断奶仔猪因其日粮和饲养环境的变化，易产生应激反应，包括腹泻和死亡等，因此需从调控营养、建立健康肠道菌群等多方面对断奶仔猪进行保健[7]。目前，已有多项研究证实，给断奶仔猪饲喂益生菌可提高仔猪肠道健康，增加免疫力及机体的抵抗能力，促进其自身健康生长[3-6]。朱原等综述了益生菌在建立仔猪健康肠道环境中的作用，主要通过病原抑制、改善肠上皮屏障功能、提高免疫力、调节肠道微生物组成和生成短链脂肪酸等途径[1-2]。

已有多项研究探索了单一菌株对断奶仔猪生长性能的影响，发现干酪乳杆菌可降低仔猪腹泻率，并提高其抗氧化能力，但其对平均日增重、平均日采食量和料重比没有影响[4]。另外，在饲料中添加约氏杆菌可显著改善断奶仔猪耗料增重比，并提高其肝脏指数，同时，病理观察结果显示添加约氏杆菌对断奶仔猪的各组织均无不良影响[3]。多种菌株通过不同途径改善仔猪生长性能。

近年来，复合益生菌的使用日益频繁，多菌株协同作用效果往往超过单一菌株。张德晓等使用凝结芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌制备复合菌制剂，其可改善仔猪29～60日龄平均日采食量、平均日增重和料重比，但结果并不显著[5]。杨玲等探讨饲粮中添加含丁酸梭菌的复合益生菌对断奶仔猪饲粮中的抗生素替代效果，分别用含丁酸梭菌的复合益生菌替代0%、50%和100%的抗生素。观察到替代100%抗生素时可实现其生长性能与抗生素组效果相当，而且能降低腹泻率[8]。曾秀玲等研究了枯草芽胞杆菌、酵母菌和乳酸菌三者组合的复合益生菌对早期断奶仔猪生长性能和体液免疫水平的影响，观察到饲喂益生菌的仔猪日增重增加，体液免疫功能提升，且腹泻率显著降低[9]。祝永才报道了使用酿酒酵母菌-枯草芽孢杆菌复合益生菌可有效提高断奶仔猪的生长性能，在基础日粮中添加0.30%复合益生菌，可显著提高试验组末重、平均日增重和平均日采食量[10]。与之前报道一致，此次研究中，饲喂由干酪乳杆菌、屎肠球菌和约氏乳杆菌制备的复合菌乳膏剂的断奶仔猪日增重、饲料增重比和末均重均显著优于对照组。新采用的乳膏剂剂型可提高益生菌存活率，从而提高益生菌的作用效果。同时，我们还观察到饲喂复合菌乳膏剂的仔猪腹泻率略微升高，这可能是由于试验中部分仔猪出现了粪便不成型的情况，因此干扰了腹泻的判断和统计。之前有研究报道，在基础日粮中添加0.20%复合益生菌，其腹泻率显著高于添加0.30%复合益生菌[10]，因此，可考虑继续优化乳膏剂中活菌数来改善这一问题。

目前，大多数关于复合益生菌的研究集中在菌株类型，此次研究首次改善了益生菌饲喂制剂的剂型，用乳膏型替代液体[6]和固态粉[3,4]等两种传统剂型。对于液态菌制剂，往往需要在低温下保存，方可保持菌活性；而固态菌制剂溶解性差，生产成本高，在冻干制备过程中会影响菌活性。在此次的研究结果中，将4种常用复合菌进行组合，经过优化的益生菌乳膏剂活性成分为干酪乳杆菌、屎肠球菌[11]和约氏乳杆菌，由这3种菌组合成的复合菌制剂在常温下保存56 d仍可保持活菌数高于108cfu/g，在方便储存和使用的同时，仍可保证益生菌制剂的效果。

5 结论

此次研究中，使用干酪乳杆菌、屎肠球菌和约氏乳杆菌制备了复合益生菌乳膏剂，在室温下可稳定保存超过1个月，在断奶仔猪中使用可有效提高平均日增重和末均重、降低饲料增重比，从而提高其生长性能，在仔猪保健中可发挥有效作用。