锌在精神应激致肠易激综合征发生、发展过程中的影响

李莹杰

同济大学附属同济医院营养科，上海 200065

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一种以腹痛或腹部不适伴有排便习惯和粪便性状改变为主要表现的功能性胃肠道疾病，其发病率为10%～20%[1]。IBS是多因素相互作用的结果，其中，内脏高敏感是其核心发病机制[2]。同时，IBS的形成也与精神心理因素如抑郁、焦虑、感染等有关[3]。虽然IBS不危及患者生命，但严重影响患者生活质量，增加患者精神压力和经济负担，因此，IBS的发病机制和有效治疗方案是当前亟需解决的问题。有研究[4]发现，IBS患者的头发检测显示锌含量与健康者对比明显缺乏，且部分患者未经任何治疗，单纯服用富含微量元素锌的矿泉水后，腹胀、腹痛、排便习惯的改变等一系列症状均明显改善。

微量元素锌在体内参与多种酶的组成及生理功能，在神经系统中分布尤其丰富，其中海马中锌离子分布较多。锌含量的变化对免疫、内分泌及某些神经递质有较大的影响。而慢性精神应激对机体锌含量的变化也有重要影响。在我们的既往研究中发现，慢性精神应激导致皮质醇(cortisol, CORT)升高的同时，大鼠的血清锌水平显著下降，同时锌表观吸收率和海马锌含量下降[5]。在慢性精神应激过程中由于HPA轴被激活，血清CORT含量升高，引起锌能神经元突触末梢内锌离子释放，而锌浓度的升高或降低均可影响氨基酸神经递质的传递，包括5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素、多巴胺等。其中5-HT受体及其转运体在肠道动力紊乱、内脏感觉异常等机制中发挥重要作用[6-7]。另外,锌还能影响膜结构的稳定性及其功能，抑制肥大细胞脱颗粒及血小板释放5-HT。过去有关特定脑区内突触后锌离子的研究主要集中于海马及前额叶对学习、记忆功能的影响，而对海马内锌离子与内脏感觉调节关系的研究尚缺乏。

因此,本研究一方面旨在探讨慢性精神应激致内脏高敏过程中海马内及血清内锌离子的变化,另一方面探讨锌离子的变化是否可能会通过影响与内脏高敏感形成相关的某些神经递质，如5-HT、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)、蛋白激酶 A(protein kinase A，PKA)等影响IBS的发生发展。

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁级雄性SD大鼠60只，体质量180～200 g，经同济大学附属同济医院实验动物中心购买。大鼠运达实验中心并经1周适应性饲养后，开始进行正式实验。大鼠饲养笼使用前均经过紫外线照射及消毒。大鼠饲养房间内保持恒温(25±2)℃，湿度50%～60%，使用标准饲料与自来水常规饲养。实验过程中符合实验动物福利伦理原则。

1.2 实验试剂Trizol 裂解液、反转录试剂盒和qRTPCR扩增试剂盒购自日本Takara 公司。PCR引物购自上海生工生物有限公司。ELISA试剂盒购自R&D Systems公司。其余试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 动物分组将60只雄性SD大鼠分为两组：慢性避水应激组和正常对照组，每组30只。

实验动物模型建立：应用慢性避水应激方法给予慢性避水应激组大鼠慢性精神刺激，在25 cm×25 cm×45 cm的水箱中竖置8 cm×8 cm×10 cm的平台，向水箱内加水(常温)，水面距平台最高点1 cm，每日上午9:00开始将大鼠置于水箱中的平台上站立1 h，实验连续进行10 d。10 d后记录大鼠内脏敏感性[8]。正常对照组大鼠给予正常饮食，每2 d称重1次。

慢性避水应激实验结束后，对两组大鼠进行内脏敏感性评估。评估方法采用以球囊直肠扩张引起大鼠腹部收缩反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)的最小容量阈值来进行半定量评分。评估前大鼠禁食24 h，饮水不限制。评估过程中，将大鼠置于特殊改装的透明塑料容器中，使得大鼠只能前后运动，无法转身。实验过程中使用的球囊和导管在进入大鼠肛门前先用石蜡油润滑，插入肛门后球囊的末端距离肛门口约1 cm，同时使用胶布将导管与大鼠尾巴固定在一起。AWR评分标准为：大鼠无明显行为变化为0分；身体不动，仅有轻微的头部运动为1分；腹部肌肉开始收缩，但下腹壁未抬离桌面为2分；下腹壁抬离桌面为3分；大鼠身体呈弓状，伴骨盆抬起为4分。由非实验者观察并记录给予不同球囊注水量时大鼠的AWR评分，重复3次，每次给予扩张之间间歇3 min，取3次实验的平均分[9]。

1.4 指标测定

1.4.1 大鼠血清锌离子及海马锌离子含量的测定：大鼠用戊巴比妥钠麻醉后，心脏取血，所采血液样本静置15～20 min后置于高速离心机，3 000 r/min,离心15 min，离心后使用移液器吸取管内上层血清，并转入新的离心管内备用。大鼠采血后使用4 ℃质量浓度为9 g/L的生理盐水进行心脏灌流，灌流后再注射过量麻药处死，处死后将大鼠头取下置于冰上并迅速将海马取出称重后加入硝酸及高氯酸4∶1混合液高温消化，消化后导出至5 ml容量瓶中并用去离子水定容，采用原子吸收分光光度计火焰法测定其中血清锌离子和海马锌离子含量。

1.4.2 实时定量荧光PCR(RT-PCR)测定大鼠海马内相关因子mRNA表达量：通过RT-PCR测定大鼠海马内5-HT、BDNF、CREB、PKA mRNA的表达水平。取出大鼠海马组织，根据RNA提取试剂盒的说明步骤提取总RNA后，再进行逆转录，而后进行PCR反应。RT-PCR过程中所使用的引物序列如下：5-HT 上游：5′-AGGACCACGGCTACACCATCTAC-3′，下游：5′-CTGACAGTCTTGCGGATTCGGAAG-3′； CREB 上游：5′-TGTTGTTCAAGCTGCCTCTGGTG-3′，下游：5′-GCTTCTTCAGCAGGCTGTGTAGG-3′；BDNF上游：5′-TGGAACTCGCAATGCCGAACTAC-3′，下游：5′-TCCTTATGAACCGCCAGCCAATTC-3′；PKA上游：5′-GGACAAGCAGAAGGTGGTGAAGC-3′，下游：5′-ACCAGGCACGTACTCCATGACC-3′；β-actin上游：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游：5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。

1.4.3 ELISA测定大鼠海马内相关因子蛋白含量：按照ELISA试剂盒说明书测定大鼠海马内5-HT、BDNF、CREB、PKA蛋白含量。

1.5 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。对计量资料进行正态性检验，统计方法采用配对样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 内脏敏感性评估慢性避水应激组大鼠与正常对照组大鼠相比，AWR评分明显升高，差异有统计学意义(P<0.05，见图1)。

又一只白鹫闪电般落下，爪下的土狼向旁一跳，却仍被利爪勾破了肚皮。爪尖穿透肚肠，拽着这根肠子的一端飞上了天，另一端却仍留在土狼的肚子里，就像从高空垂到地面的一条血淋淋的绳索。土狼的叫声像厉鬼一般歇斯底里，在肠子的拉扯下，它的身体在地面上滑出一条带血的长痕，在撞到一块巨石后，肠子终于被扯断。它的四肢抽搐了几下，便再也不动弹。

2.2 锌离子含量慢性避水应激组大鼠与正常对照组大鼠相比，海马锌离子含量显著下降，血清锌离子含量也下降，差异有统计学意义(P<0.05，见图2)。

注：与正常对照组比较，*P<0.05。

注：与正常对照组比较，*P<0.05。

2.3 海马内各相关因子mRNA及蛋白含量的变化通过RT-PCR及ELISA检测发现，慢性避水应激组大鼠与正常对照组大鼠海马内5-HT、CREB、BDNF、PKA mRNA含量及蛋白表达量相比均明显下降，差异有统计学意义(P<0.05，见图3)。

注：A: 5-HT mRNA表达；B: PKA mRNA表达；C： CREB mRNA表达；D: BDNF mRNA表达；E: 5-HT蛋白表达；F: CREB蛋白表达；G: BDNF蛋白表达；H: PKA蛋白表达。与正常对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

大量流行病学研究观察了精神应激与功能性胃肠病症状发生和加重的关系。而在精神心理因素中抑郁及焦虑常被IBS患者作为第一主诉，给予抗焦虑、抑郁等药物治疗后患者消化道症状可得到明显改善[10]。这提示精神状态的改变可能参与IBS内脏高敏感发病机制。

微量元素锌在体内参与多种酶的组成及生理功能，在神经系统中分布尤其丰富，是维持神经系统功能必需的元素之一。锌含量的变化对免疫、内分泌变化及某些神经递质有较大的影响，进而还会影响人的精神状态、思维及认知等。脑中的自由锌绝大部分位于谷氨酸能神经末梢，锌离子在谷氨酸的贮存、释放和再摄取方面可能发挥着重要作用或参与了谷氨酸受体的调节。

机体锌稳态易受到胞外各种病理生理环境因素的影响，如炎症、氧化应激等，实验证明，在应激条件下，胞内游离锌离子浓度可显著上升，进而导致细胞损伤。我们既往研究也发现，精神应激可导致血清锌水平显著下降和胞内游离锌浓度显著升高。说明锌在精神应激过程中可能具有重要作用，一方面，各种应激导致胞内游离锌浓度上升，使锌在胞内产生毒性作用，造成细胞损伤；另一方面，应激导致机体血清锌下降，并可能导致体内锌的重新分布，从而影响机体的抗应激能力[11-12]。

Barbara等[13]通过检测IBS患者直肠黏膜中肥大细胞发现, 其中活化脱颗粒肥大细胞数目明显增加, 且与直肠高敏感和症状严重程度相关。而锌能影响肠道黏膜结构的稳定性及其功能，抑制肠道肥大细胞脱颗粒。提示锌的缺乏可能影响IBS的内脏高敏感程度。

锌缺乏可使大鼠海马和皮层中cAMP水平显著增加，使PKA 活性显著降低。有关研究[14]也通过实验证实NMDA受体在IBS患者肠黏膜表达升高，并通过成熟BDNF促进IBS内脏高敏感的发生。另，慢性温和应激可明显抑制大鼠海马齿状回BDNF蛋白的表达和CREB的磷酸化[15]，表明海马部位的BDNF表达水平升高在应激适应或抵抗过程中可能起关键作用。同时BDNF在中枢有致痛和致敏感性作用[16]，对人肠上皮屏障功能和肠道动力也有影响[17]，其异常表达可导致慢性疼痛、炎症性疼痛和内脏疼痛及高敏感异常感觉的产生。研究发现，慢性束缚应激可导致大脑内部分区域BDNF的mRNA和蛋白表达增加[18]。CREB是广泛存在于神经细胞核内的一种转录因子, 有研究表明，细胞内锌的缺乏会减少CREB的表达和活力，而外源性的锌的补充能够恢复神经细胞和其他细胞系统中CREB的表达和活力[19]。

本研究检测了慢性避水应激组大鼠与正常对照组大鼠海马内5-HT、CREB、BDNF及PKA mRNA含量及蛋白表达量，发现与正常对照组大鼠相比，慢性避水应激组大鼠均有明显下降，差异有统计学意义。 我们猜测可能是海马内锌离子的变化影响了许多含锌酶的活性，这些酶的活性又与CREB、BDNF等转录因子的活性相关，以上因子的活性下降导致了内脏高敏的形成。

综上所述，我们推测在慢性精神应激后，海马内突触末梢释放的锌离子信号有可能作用于突触后膜的5-HT受体，再通过cAMP-PKA通路激活CREB的磷酸化，调节下游的BDNF表达，最终造成内脏高敏感，引起IBS。

本研究初步探索了在精神应激诱发的IBS发生、发展过程中机体锌离子的变化，以及锌离子变化的同时机体内与内脏高敏形成相关因子的变化情况，为精神应激相关IBS发病的机制研究提供了一个新思路，但海马内锌离子与内脏感觉调节的具体机制有待进一步做深入的干预研究。