臭氧处理降解小麦中呕吐毒素的研究

徐晓滢 樊艳 徐杨颖 周建新

[摘要]：本文在高效液相色谱法测定呕吐毒素（DON）改进的基础上，研究了小麦籽粒中呕吐毒素分布和臭氧处理对小麦中呕吐毒素的降解。结果表明利用改进的高效液相色谱法对样品中呕吐毒素测定，矫正曲线在0～5.0μg/ml，線性关系良好，相关系数达到0.999 8，选择三个不同水平的加标回收试验，回收率在85.0%～105%。呕吐毒素主要存在于麸皮中，臭氧处理可以降解40%以上的呕吐毒素。

[关键词]小麦;呕吐毒素;臭氧;高效液相色谱法

中图分类号：TS211 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.202002

真菌毒素是由各自所属的真菌代谢生成的有机代谢物，广泛分布在自然界中，对人类的食物和饲料造成了广泛的污染，造成数以千万计的经济损失。真菌毒素属于天然化学污染物，目前，人们可以确定检测的真菌毒素大概有300种，由350种真菌产生[1]。其中呕吐毒素（学名为脱氧雪腐镰刀菌烯醇，简称DON）现在被认为是世界上常见的危害物中最危险的类型之一，在镰刀菌毒素之中，呕吐毒素对谷物造成的污染率和污染水平是最高的[2]。世界上很多国家都通过法规或者标准严格规定了呕吐毒素在粮食及其制品中限量。因此，如何去除谷物（特别是小麦和玉米）中的DON毒素，以减少其进入面制品甚至食物链的研究需求越来越迫切。呕吐毒素降解的方法主要有物理、生物和化学方法。由于呕吐毒素具有耐热性，导致物理方法的适用性不强，且降解产物难以确定，也难以做出安全性评判;生物方法降解真菌毒素的研究已经取得了一定的进展，具有高效性和专一性，但性价比较低且较难适用于固体。化学方法主要是通过强酸、强碱或者强氧化剂对物质的分子结构进行破坏，致使毒素被降解[3]。近年来，臭氧被利用于减少粮食和食品中的真菌毒素如赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1的研究比较多，在实践中也得到肯定[4-8]，对于臭氧降低小麦中呕吐毒素的研究相对较少。臭氧自身具有很大优势：它可以迅速破坏有机物中的双键;具有极强的渗透性;可以分解为氧气，不会产生有毒残留，对环境无不良影响[9]，所以研究臭氧降解小麦中的DON含量的工艺参数，对于确保食品安全，具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 样品

小麦样品来自江苏南通，2017年3月9日采样。其中，样品A呕吐毒素污染程度高;样品B呕吐毒素污染程度低。

1.2 主要仪器与设备

高效液相色谱仪（2707-1525-2998）：美国Waters公司;Bond Elut Mycotoxin多功能净化柱（12165001B）：美国Agilent公司;臭氧灭菌箱（JR-Y10）：南京金仁环保科技有限公司;旋转式粉碎机（D-47055）：德国brabender公司;高速离心机（GL-21M）：上海耐圣卡兰实业有限公司;涡旋振荡器（QL-862）：Qilinbeier公司;氮吹仪（N- EVAPTM112）：美国Organomation Asso-ciates公司;Clover C18色谱柱（4.6mm×250mm）、填料（粒径5μm）：美国Waters公司。

1.3 试剂

呕吐毒素标准品：美国Sigma公司;甲醇、乙腈（色谱纯）：德国LiChrosolv公司。

1.4 呕吐毒素的检测方法研究

1.4.1 色谱条件

检测波长：218nm;流动相：甲醇∶水（20∶80）;柱温：35℃;流速：0.8mL/min;进样量：50μL;根据样品的峰保留时间对样品进行定性，根据峰面积外标法对样品进行定量。

1.4.2 样品制备

参照《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》（GB 5009.111-2016）[10]中的免疫亲和层析净化高效液相色谱法，并对试样提取、净化和洗脱等步骤进行了改进：称取25g磨碎的小麦样品于离心杯中，加入乙腈∶水=84∶16（V∶V）溶液100mL，手持离心杯在涡旋振荡器上振荡3min，经高速离心机（10 000r/min）离心20min，准确吸取上清液4mL，注入玻璃注射器中，连接空气压力泵，设置通过时间为5min，在压力作用下使溶液快速通过多功能净化柱，收集滤液。氮吹滤液至溶剂全部被吹干，然后使用乙腈∶水=20∶80（V∶V）溶液1mL复溶。将复溶溶液过0.22μm微孔滤膜，溶液收集于2mL样品瓶中待高效液相色谱仪分析。

1.4.3 回收率测定

取阴性样品的小麦磨碎，称取25g至于离心杯中，共5份，分别向其中添加浓度为0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg的DON标准品，进行处理与检测，处理步骤同样品制备。

1.4.4 预处理平行试验

取小麦样品中DON超标的小麦芯粉样品6份，进行处理与检测，处理步骤同样品制备。

1.5 呕吐毒素含量在小麦籽粒中的分布

小麦碾磨工艺按照我国农业部颁布的《小麦实验制粉 第1部分：设备、样品制备和润麦》（NY/T 1094.1-2006）[11]执行。打开粉碎机，使其正反空转各5min，直至到收集仓中不再出现粉末。打开转向旋钮，从入口处缓慢投入过筛后的小麦样品100g，碾磨结束后，两个收集仓分别有麸皮和芯粉，将其分开取出存放。之后采取上述除尽粉末残留的方法反复收集，使样品充分碾磨。

1.6 臭氧处理对小麦中呕吐毒素含量的影响

1.6.1 臭氧处理时间对小麦中呕吐毒素含量的影响

小麦样品A 5份，将臭氧处理时间分别设置为30min、60min、90min、120min、150min，处理浓度10g/h取出，按2.4方法测定呕吐毒素含量。

1.6.2 臭氧处理浓度对小麦中呕吐毒素含量的影响

小麦样品A 4份，将臭氧浓度分别设置为2.5g/h、5g/h、7.5g/h和10g/h，处理时间90min后取出，按2.4方法测定呕吐毒素含量。

2 结果与讨论

2.1 高效液相色谱法测定小麦中呕吐毒素的方法2.1.1 校正曲线及回归方程

将呕吐毒素标准品配制系列标准溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/mL，有低到高浓度依次进样检测，得到如图1所示的呕吐毒素校正曲线，相关系数0.999 871，回归方程为Y=7.579 58×104-3.094 061 ×103。呕吐毒素的标准图谱如图2所示。

2.1.2 加标回收实验

分别做500μg/kg、1 000μg/kg、2 000μg/kg三个添加水平的回收试验，结果如表1所示。

2.1.3 预处理平行实验

样品A的芯粉样品，进行从预处理开始的5次重复试验，其实验结果数据如表2所示。

2.1.4 精密度实验

对于同一个经过预处理的小麦样品，在高效液相色谱中重复进样6次，可得到含量数据如表3所示。

由上述实验可知，在0～5.0μg/ml时线性关系良好，相关系数达到0.999，不同水平的回收率在85.0%～105%，预处理平行实验的相对标准偏差为12.37%，多次进样精密度实验相对标准偏差为3.9%。该方法准确可靠，简便易行。

2.2 小麦籽粒中呕吐毒素的分布情况

碾磨100g小麦，称量得到的麸皮和芯粉的重量。其中麸皮约25g，占比25%;芯粉约70g，占比70%，其余为损耗。测定结果如表4所示。对于DON污染程度高的样品A，全麦粉中呕吐毒素含量为4 590μg/kg，是国家标准限量4.5倍（限量1 000μg/kg），麸皮中的呕吐毒素含量是芯粉中的2倍。对于DON污染程度低的样品B，所有的DON都集中分布于麸皮中，芯粉中不含有DON。

2.3 臭氧处理对小麦中呕吐毒素含量的影响

2.3.1 臭氧处理时间对小麦中呕吐毒素的影响

将样品A分别在相同臭氧浓度（10g/h）处理不同时间后取出，碾磨，对DON含量进行检测，结果如表5所示。由表5可知，小麦籽粒中的DON都因为臭氧处理而降低，且降解率与处理时间呈正相关。

2.3.2 臭氧处理浓度对小麦中呕吐毒素的影响

将小麦样品分别置于5个浓度梯度的臭氧环境中90min，然后测得其中的DON含量如表6所示。由DON的变化趋势图可以看出，相同处理时间内，当改变臭氧浓度对小麦进行讲解处理。在浓度小于7.5g/h时，小麦全麦粉中中DON的含量也会逐渐下降，且降低速率逐渐减小，浓度为7.5g/h时，降解率为41.18%，继续提高臭氧浓度，DON的降解率的变化则在3%左右，下降效果不明显。麸皮与芯粉的变化趋势与小麦粉相同。所以，当臭氧处理小麦的时间为90min的时候，臭氧降解DON的浓度可选择7.5g/h。

3 结 论

本方法与《食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》（GB 5009.111-2016）相比，在试验提取、净化和洗脱方面，本实验采用均质并离心后提取上清液的方式，对呕吐毒素进行溶解，利用多功能净化柱对其进行净化。由精密度检测结果可知平行实验相对标准偏差为12.37%，仪器精密度测试相对标准偏差为3.9%，方法具有可行性。

DON在麸皮中的含量都要高于在芯粉中的含量，主要分布在麸皮中，通过去皮，可去除部分呕吐毒素。

随着臭氧处理浓度的提高和时间的延长，小麦籽粒中DON降解率逐渐提高，臭氧处理浓度7.5g/h和时间为90min时，降解率可达到45%。

参考文献

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[10] GB 5009.111-2016，食品中脫氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定[S].

[11] NY/T 1094.1-2006，小麦实验制粉 第1部分：设备、样品制备和润麦[S].

收稿日期：2019-12-23

基金项目：江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）;江苏高校品牌专业建设工程资助项目（TAPP）。

作者简介：徐晓滢，女，博士，研究方向为食品化学。

通信作者：周建新，男，硕士，研究方向为粮油储藏。