广西不同养殖模式猪源大肠杆菌耐药表型差异性分析

冯世文 李军 潘艳

摘要：为调查广西不同养殖模式的猪源大肠杆菌耐药表型差异，为合理使用抗菌药物防治猪大肠杆菌病和减缓耐药菌株产生提供参考，采用体外分离培养和体外药敏试验的方法，分离了广西不同养殖模式的猪源大肠杆菌，并进行耐药表型检测和差异性分析。结果显示，大规模养猪场、中小规模养猪场和散养户的猪源大肠杆菌对头孢西丁、头孢他啶和阿米卡星的敏感率高于70%，而对青霉素G、氨芐西林、阿莫西林、利福平、林可霉素和复方新诺明的耐药率均高于90%。大规模养猪场大肠杆菌对恩诺沙星的耐药率极显著低于散养户（P<0.01），对氧氟沙星、庆大霉素和氟苯尼考的耐药率显著低于散养户（P<0.05）;中小规模养猪场大肠杆菌对恩诺沙星、强力霉素和氟苯尼考的耐药性显著低于散养户（P<0.05）;散养户大肠杆菌对环丙沙星、卡那霉素和壮观霉素的耐药率极显著高于大规模养猪场和中小规模养猪场（P<0.01），而对头孢噻肟的耐药率极显著低于大规模养猪场和中小规模养猪场（P<0.01）。大规模养殖场、中小规模养殖场和散养户大肠杆菌的多重耐药指数（MARI）分别为0.62、0.63和0.68。14～23耐，散养户（44株）极显著高于大规模养猪场（30株）（P<0.01），显著高于中小规模养猪场（39株）（P<0.05）。结果表明，3种养殖模式的猪源大肠杆菌的耐药情况不同，但均存在严重的耐药问题，且以多重耐药为主。

关键词：养殖模式;猪源致病性大肠杆菌;耐药性;广西

中图分类号：S858.28         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）01-0114-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.01.025           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： This study was to investigate the difference of drug resistance phenotype of E. coli isolated from different pigs cultivation modes in guangxi， and to provide a reference for the scientific use of antimicrobial drugs of swine colibacillosis and to slow down the drug resistant strains. E. coli from different pigs cultivation modes in Guangxi was isolated and identified， and the drug-resistant phenotype was tested and analysis. The results showed that， the E.coli isolates from three pigs cultivation modes were highly sensitive to cefoxitin， ceftazidime and amikacin， the sensitive rate up to 70%， while highly resistant to penicillin G， ampicillin， amoxicillin， rifampicin， lincomycin and sulfamethoxazole， the resistance rate up to 90%. The resistance rate of E.coli from large scale pig farms against enrofloxacin was extremely significantly lower than free-range farming （P<0.01）， the resistance rate of E.coli from large scale pig farms against ofloxacin， gentamicin， florfenicol were significantly lower than free-range farmers （P<0.05）. The resistance rate of E. coli from small and medium-sized pig farms against enrofloxacin， doxycycline and florfenicol were significantly lower than free-range farmers （P<0.05）. The resistance rate of E. coli from free-range farmers against ciprofloxacin， kanamycin， spectinomycin were extremely significantly higher than large scale pig farms and small and medium-sized pig farms（P<0.01）， while the resistance rate against cefotaxime was extremely significantly lower than large scale pig farms and small and medium-sized pig farms（P<0.01）. The multiple antibiotics resistance index （MARI） of E. coli from large scale pig farms， small and medium-sized pig farms and free-range farmers was 0.62， 0.63 and 0.68. 14 to 23 resistant E. coli strains accounted in free-range farming， which was extremely significantly higher than large scale pig farms（P<0.01）， and was significantly higher than small and medium-sized pig farms（P<0.05）. The results indicated that the resistance of E. coli from different pigs cultivation mode were different but all very serious and mainly of multi-drug resistance.

Key words： cultivation mode; pig Escherichia coli; drug-resistant; Guangxi

猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的以腹泻为主的仔猪肠道传染病[1]，依据发病仔猪的临床症状、病理剖检变化以及流行病学，将该病分为仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病等。仔豬发病后发生严重腹泻，并导致脱水，败血症或继发其他疾病，仔猪发育受阻甚至死亡，给养猪业带来巨大的经济损失[2]。目前仍无有效的疫苗进行大肠杆菌病预防，采用抗菌药物防治仍是首要选择。在临床治疗过程中的滥用、无序使用抗菌药物，特别是在养殖生产中抗菌药物还作为饲料添加剂来预防和促进动物生长，这些都导致了养殖环境中抗菌药物大量残留和大肠杆菌耐药菌株的大量产生[3-5]。这些耐药菌株可以通过畜禽产品途径传递感染人类，给人类的健康安全造成严重威胁。

本试验在广西地区大规模养猪场、中小规模养殖场和散养户3种养殖模式采集仔猪腹泻粪便，分离鉴定大肠杆菌并进行体外药敏试验，分析了不同养殖模式下大肠杆菌的耐药表型差异，旨在进一步丰富广西地区猪源致病性大肠杆菌耐药性流行数据，为临床合理用药治疗猪大肠杆菌病和减缓耐药菌株产生提供参考。

1  材料与方法

1.1  样品采集

2016年于广西大规模养猪场、中小规模养猪场和散养户分别采集腹泻仔猪新鲜粪便90份，总共270份。

1.2  主要试剂

麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、营养肉汤培养基和MHA培养基购自北京陆桥技术有限责任公司;微量生化反应管和药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.3  大肠杆菌分离鉴定

无菌取新鲜粪便接种于伊红美蓝培养基，挑取黑色金属光泽单个菌落进行纯化培养、革兰氏染色、镜检，并进行生化试验。

1.4  药敏试验

3种养殖模式分离鉴定的大肠杆菌，分别随机选择60株菌株，采用NCCLS[6]推荐的K-B纸片法，选用青霉素类、头孢菌素类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类等10类共24种抗菌药物进行体外药敏试验，按照Ф≥20 mm为敏感，15 mm≤Ф<20 mm为中敏，Ф<15 mm为耐药的判定标准判读结果。

1.5  数据处理分析

计算大肠杆菌分离率（大肠杆菌分离菌株数/采样数×100%），抗菌药物的敏感率（敏感菌株数/受试菌株总数×100%）和耐药率（耐药菌株数/受试菌株总数×100%）。计算不同养殖模式大肠杆菌的多重耐药指数（MARI），计算公式为MARI=A/BC，其中A为细菌的总抗菌药物耐药值，B为检测的抗菌药物数目，C为受试的细菌菌株数，0

2  结果与分析

2.1  大肠杆菌分离鉴定

依据分离菌株的培养特性、革兰氏染色形态和生化特性，共分离大肠杆菌230株，分离率为85.2%（230/270），大规模养殖场、中小规模养殖场、散养户的分离率分别为88.9%（80/90）、86.7%（78/90）和80.0%（72/90），表明大肠杆菌是引起仔猪腹泻的主要病原菌。

2.2  耐药表型检测结果

1）大规模养殖场大肠杆菌的耐药表型。对分离自大规模养殖场的60株大肠杆菌进行体外药敏试验并统计分析，结果显示，菌株对头孢西丁、头孢他啶和阿米卡星的敏感率高于78%（图1）。大规模养殖场大肠杆菌耐药率高于90%的抗菌药物有：青霉素类（98.3%），最高为青霉素G（100%），氨苄西林和阿莫西林分别为98.3%、95.0%;利福霉素类（利福平）为95.0%，林可霉素类（林可霉素）为100%、磺胺类（复方新诺明）为100%;耐药率最低的为头孢菌素类（31.9%），其中头孢氨苄为63.3%（表1、图2）。大规模养殖场大肠杆菌的MARI为0.62，最少对7种抗菌药物耐药（1株），最多对22种抗菌药物耐药（1株），而对9种和13种抗菌药物耐药的菌株数最多，均为9株（表2）。统计结果表明，大规模养殖场大肠杆菌仅对极少数的抗菌药物具有高敏感率，对多数抗菌药物耐药且多重耐药严重。

2）中小规模养殖场大肠杆菌的耐药表型。对分离自中小规模养殖场的60株大肠杆菌进行体外药敏试验并统计分析，结果显示，菌株敏感率较高的抗菌药物有头孢西丁（91.67%）、头孢他啶（86.67%）和阿米卡星（70.00%）（图1）。菌株对青霉素G等6种抗菌药物耐药率高于90%，其中青霉素类为95.6%，最高为青霉素G（100%），氨苄西林和阿莫西林均为93.3%;利福霉素类（利福平）为93.3%，林可霉素类（林可霉素）为100%，磺胺类（复方新诺明）为100%;耐药率最低的为头孢菌素类，为32.8%，其中头孢氨苄和头孢拉定均为53.3%（表1、图2）。中小规模养猪场大肠杆菌的MARI为0.63，最少对5种抗菌药物耐药（2株），最多对22种抗菌药物耐药（3株）（表2）。统计结果表明，中小规模养猪场大肠杆菌仅对极少数的抗菌药物具有高敏感率，对多数抗菌药物耐药且具有复杂的多重耐药谱。

3）散养户猪源大肠杆菌的耐药表型。对分离自散养户的60株大肠杆菌进行体外药敏试验并统计分析，结果显示，敏感率较高的抗菌药物有头孢噻肟（88.33%）、头孢西丁（88.33%）、头孢他啶（83.33%）和阿米卡星（80.00%）（图1）。散养户猪源大肠杆菌除了对头孢菌素类（27.5%）和大环内酯类（60.0%）的耐药率较低，对其他抗菌药物均具有较高的耐药率，如青霉素类为96.7%，其中氨苄西林和阿莫西林均为93.3%，最高为青霉素G（100%）;氟喹诺酮类为84.6%，其中氧氟沙星为81.7%，环丙沙星为88.3%，最高为恩诺沙星（90.0%）;氨基糖苷类为68.3%，最高为卡那霉素（100%）;四环素类（强力霉素）为95.0%，利福霉素类（利福霉素）为96.7%，林可霉素类（林可霉素）为100%，磺胺类（复方新诺明）为100%，酰胺醇类（氟苯尼考）为86.7%（表1、图2）。散养户大肠杆菌的MARI为0.68，最少对9种抗菌药物耐药（2株），最多对23种抗菌药物耐药（1株），其中对21种抗菌药物耐药的菌株数最多，为11株（表2）。统计结果表明，散养户猪源大肠杆菌除了对3种头孢菌素类和阿米卡星具有较高的敏感性外，对其他20种抗菌药物均表现出明显的耐药性，且多重耐药情况极其复杂。

2.3  猪源大肠杆菌在不同养殖模式中的耐药性差异分析

3种养殖模式的猪源大肠杆菌对头孢西丁、头孢他啶和阿米卡星的耐药率均低于20%，差异不显著（P>0.05）;对青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、利福平、林可霉素和复方新诺明的耐药率均高于90%，差异不显著（P>0.05）（表1），表明3種养殖模式的猪源大肠杆菌对抗菌药物耐药表型有一定的相似性。

对于诺氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、氟苯尼考、链霉素和庆大霉素6种抗菌药物，散养户大肠杆菌的耐药率最高，中小规模养殖场大肠杆菌的耐药率次之，而大规模养殖场大肠杆菌的耐药率最低;对于卡那霉素、壮观霉素和强力霉素，散养户大肠杆菌的耐药率高于大规模养殖场，而大规模养殖场高于中小规模养殖场。其中，大规模养猪场大肠杆菌对恩诺沙星的耐药率极显著低于散养户（P<0.01），而与中小规模养猪场相比差异不显著（P>0.05）;其对氧氟沙星、庆大霉素和氟苯尼考的耐药率显著低于散养户（P<0.05），而与中小规模养猪场相比差异不显著（P>0.05）;其对链霉素的耐药率显著低于中小规模养猪场和散养户（P<0.05）。中小规模养猪场大肠杆菌对恩诺沙星、强力霉素和氟苯尼考的耐药率显著低于散养户（P<0.05），其与大规模养猪场相比差异不显著（P>0.05）。散养户大肠杆菌对环丙沙星、卡那霉素和壮观霉素的耐药率极显著高于大规模养猪场和中小规模养猪场（P<0.01）;其对头孢噻肟的耐药率极显著低于大规模养猪场和中小规模养猪场（P<0.01）;其对阿米卡星的耐药率显著低于中小规模养殖场（P<0.05），与大规模养猪场比较差异不显著（P>0.05）（表1）。统计分析结果表明，猪源大肠杆菌对抗菌药物的耐药情况复杂，具体到某种抗菌药物的耐药率，与饲养模式不完全具有相关性。

2.4  猪源致病性大肠杆菌在不同养殖模式中的多重耐药性差异比较

按照Magiorakos等[8]的多重耐药肠杆菌科细菌定义，耐3类及以上的肠杆菌为多重耐药菌。统计结果显示，大规模养殖场、中小规模养殖场和散养户大肠杆菌的MARI分别为0.62、0.63和0.68，表明3种养殖模式的大肠杆菌均具有严重的耐药性。其中，大规模养殖场大肠杆菌的多重耐药数为7～22耐，中小规模养殖场大肠杆菌的多重耐药数为5～22耐，散养户大肠杆菌的多重耐药数为9～23耐（表2）。对于9重耐药和13重耐药，大规模养猪场的大肠杆菌菌株数显著高于中小规模养猪场和散养户（P<0.05），而中小规模养猪场与散养户相比差异不显著;对于21重耐药，散养户的大肠杆菌菌株数显著高于大规模养猪场（P<0.05），与中小规模养猪场比较差异不显著（P>0.05）。对于14～23重耐药，散养户的大肠杆菌菌株数（44株）极显著高于大规模养猪场（30株）（P<0.01），显著高于中小规模养猪场（39株）（P<0.05）（表2）。结果表明，3种养殖模式的大肠杆菌均具有严重的多重耐药情况，其中散养户的大肠杆菌以14～23重耐药为主，情况最为严重。

3  讨论

在广西的大规模养猪场、中小规模养猪场和散养户采集仔猪腹泻粪便用于大肠杆菌分离鉴定，并进行体外药敏试验，调查了本地区3种养殖模式下大肠杆菌对10类共24种抗菌药物的敏感性和耐药表型并进行了耐药差异性分析。调查结果显示，大规模养殖场、中小规模养殖场、散养户的致病性大肠杆菌分离率分别为88.9%（80/90）、86.7%（78/90）和80.0%（72/90），表明大肠杆菌是引起仔猪腹泻的主要病原菌。

抗菌药物敏感性检测结果显示，3种养殖模式的猪源大肠杆菌仅对头孢菌素类、氨基糖苷类的阿米卡星和大环内酯类的阿奇霉素有较高的敏感率，其中敏感率较高的为头孢西丁、头孢他啶和阿米卡星，与魏雅静等[9]、夏利宁等[10]报道的结果相似，可能的原因是头孢菌素类价格贵，临床用药较少，此外阿米卡星和阿奇霉素禁用于养殖业之后，大肠杆菌对其敏感程度可能增强。

3种养殖模式的猪源大肠杆菌均对青霉素类（青霉素、氨苄西林和阿莫西林）、利福霉素类（利福平）、林可霉素类（林可霉素）和磺胺类（复方新诺明）抗菌药物具有极高的耐药率，且高于其他抗菌药物，这与国内近年来的调查结果相似，如河南、上海、山东、广东等地猪源大肠杆菌对氨苄西林、阿莫西林、复方新诺明耐药率极高[11-17]。此外，3种养殖模式猪源大肠杆菌对四环素类的强力霉素、氟喹诺酮类和酰胺醇类的氟苯尼考的耐药率均高于65%，与以前的调查结果[9，18，19]相比，耐药率显著升高。调查发现，有些抗菌药物不仅是用于临床治疗，在日常的饲养过程中也添加到饲料中或者直接肌注作为预防用药。作为新型的动物专用的抗菌药物氟苯尼考[20]，1988年研制成功，1999年中国将其批准为2类新兽药，尽管上市时间仅有十几年，但其耐药率在3种养殖模式下均高于68%，特别是散养户大肠杆菌的耐药率高达86.7%。据报道，广东猪源大肠杆菌对氟苯尼考的耐药率也高达83.71%[16]，可能与该药物在临床上广泛且不合理使用有关。

3种养殖模式的大肠杆菌耐药情况对比分析发现，对于恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、卡那霉素、强力霉素、壮观霉素和氟苯尼考等抗菌药物，大规模养猪场、中小规模养猪场大肠杆菌的耐药率极显著低于或显著低于散养户。对于诺氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、氟苯尼考、链霉素和庆大霉素6种抗菌药物，散养户大肠杆菌的耐药率最高，中小规模养殖场次之，而大规模养殖场最低。

多重耐药结果统计分析显示，大规模养殖场、中小规模养殖场和散养户的MARI分别为0.62、0.63和0.68，表明3种养殖模式的猪源致病性大肠杆菌均具有严重的多重耐药性，高于孙理云等[17]调查的集约化猪源菌MARI的0.57，高于Su等[21]调查华南家畜粪肠杆菌MARI的0.56。统计结果显示，对于14～23重耐药，散养户的大肠杆菌菌株数（44株）极显著高于大规模养猪场（30株）（P<0.01），显著高于中小规模养猪场（39株）（P<0.05），表明散养户的多重耐药更为严重。

隨着养猪业的快速发展，受市场风险和环保要求影响，散养户逐步被淘汰，部分中小规模养殖场遭淘汰，大规模集约化养殖将成为主要的养殖模式，同时随着生态养殖模式在大规模养殖场得到推广应用，可能降低抗菌药物的使用种类、使用频率和使用量，有利于减缓耐药菌株的产生，大规模养殖场与中小规模养殖场的大肠杆菌耐药情况可能出现显著性差异。

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