植物DNA甲基化研究进展

高弘扬 许丹芸 周良云 罗碧 杨全

摘 要：植物经常暴露在各种生物和非生物的胁迫之下，这些胁迫会影响植物的生长发育和繁殖并最终导致植物死亡。为了抵御不利的环境条件，植物已经进化出复杂而精细的网络来感知胁迫并激活防御系统。为此，植物激活许多信号转导通路，这些信号转导通路可以改变一些胁迫响应基因的表达，从而引起植物形态、生理和生化的改变以适应逆境。DNA胞嘧啶甲基化是高等真核生物的主要表观遗传机制之一，在维持基因组稳定性和调节基因表达方面起着关键作用。表观遗传变异比遗传变异更为灵活。一旦环境条件发生变化，为了适应新的环境植物都会发生表观遗传的改变。许多研究表明DNA甲基化参与植物的发育和应激反应。基于相关研究对DNA甲基化进行了综述，对植物逆境胁迫有重要意义。

关键词：植物;逆境胁迫;DNA甲基化

中图分类号：Q943   文献标识码：A   文章编号：1004-3020（2020）01-0039-06

Abstract：Plants are often exposed to a variety of biological and abiotic stresses that affect plant growth and reproduction and ultimately lead to plant death.In order to resist adverse environmental conditions，plants have evolved complex and elaborate networks to sense stress and activate defense systems.For this reason，plants activate many signal transduction pathways，which can change the expression of some stress response genes，thus causing changes in plant morphology，physiology and biochemistry to adapt to adversity.DNA cytosine methylation is one of the main epigenetic mechanisms in higher eukaryotes，which plays a key role in maintaining genomic stability and regulating gene expression.Epigenetic variation is more flexible than genetic variation.Once environmental conditions change，epigenetic changes will occur in plants to adapt to the new environment.Many studies have shown that DNA methylation is involved in plant development and stress response.DNA methylation is reviewed based on related research，which is of great significance to plant stress.

Key words：plants;stress;DNA methylation

近年來，表观遗传修饰，尤其DNA甲基化，对植物适应环境胁迫的作用日益明显[1]。DNA甲基化（DNA methylation）是真核生物基因组中最早发现的表观遗传修饰途径之一，相关研究已表明，DNA的甲基化能引起真核生物的染色质结构、DNA构象、DNA稳定性以及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而对真核生物的基因表达过程进行调控。在DNA序列中可以发生甲基化的位点有腺嘌呤的N-6位、鸟嘌呤的N-7位和胞嘧啶的N-4位以及胞嘧啶的C-5位，其中胞嘧啶的C-5位修饰是最常见的一种甲基化方式，也是目前DNA甲基化研究的重点和热点。胞嘧啶C-5位甲基化是由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下，将胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-mC）的一种化学反应。大量的研究已经表明，DNA甲基化与植物很多重要的生命过程如基因表达、抵御逆境密切相关，因此越来越引起人们的关注。并且DNA甲基化的功能取决于靶基因的性质，DNA甲基化有助于调节基因表达、转座子沉默、染色体相互作用和性状遗传。DNA甲基化主要发生在转座因子（TEs）和重复序列并且往往沉默这些区域的表达，因此对基因组的稳定性有重要作用[2]。DNA甲基化也可能与基因调控有关，但在这种情况下，取决于DNA甲基化发生的区域。另一方面，特定区域的DNA甲基化也可以在有丝分裂或甚至减数分裂中稳定遗传，起到“胁迫记忆”的作用，这些胁迫记忆与细胞程序性死亡、发育或应激反应有关，可以帮助植物抵御持续的胁迫[3]。

1 DNA甲基化的作用机制与基因表达调控

DNA甲基化是指甲基共价结合到DNA胞嘧啶（C）的第5位碳原子上。在大多数真核生物中，DNA胞嘧啶甲基化发生在CG区域，在植物中胞嘧啶甲基化也发生在CHG和CHH位点（H=A，C，or T）[4]。不同物种之间全基因组甲基化水平也有所不同，从模式植物拟南芥中5%到小麦大于20%。这种物种间的差异主要是由于重复序列的含量不同[5]。此外，在同一基因组中，胞嘧啶甲基化水平在不同的区域中也有显著差异。例如，在拟南芥中，DNA甲基化发生在CG、CHG和CHH位点分别为24%、6.7%和1.7%[6]。在水稻中，CG甲基化发生在典型的基因区域，而TEs的CHG和CHH甲基化明显富集[7]。在met1（拟南芥CG甲基化突变体）中，原本在野生型中高度甲基化的基因其表达量得到了明显的增加[8]。CG基因甲基化发生在5端，包括启动子和转录区的一部分，在3端，包括转录区域的一部分和3侧翼序列，可能抑制基因表达。已经提出了两个假说来解释这种抑制作用：一方面，在启动子和增强子区域的胞嘧啶甲基化可阻止转录因子（TF）的结合;另一方面，甲基化胞嘧啶可以招募甲基胞嘧啶结合蛋白，吸引了组蛋白去乙酰化酶和染色质重塑蛋白，压缩了染色质从而无法转录[9]。在植物中基因本体也发生甲基化，但在这种情况下，DNA甲基化作用不太明显。对基因本体甲基化的作用提出了三种不同的假说：它可以抑制编码区内隐性启动子的表达，它能提高初级转录本的正确剪接，或者它是转录没有功能的副产物。

在拟南芥中大约三分之一的基因至少部分发生甲基化;此外，在不同的品种中TEs的DNA甲基化和DNA重复序列是非常相似的，不同生态型之间有50%的甲基化差异。对Vancouver和Columbia生态型的分析表明，10%的CG序列甲基化水平具有差异。甲基化多态性多见于上游或下游基因区，与基因表达水平呈负相关。另一方面，基因的甲基化多态性与基因表达的变化没有明显的相关性。相反，在杨树中基因本体甲基化比启动子甲基化对转录的抑制作用更强[10]。

DNA甲基化模式的动力学有三个过程：DNA从头甲基化，维持甲基化和DNA脱甲基化。通过DNA复制过程中半保留机制，甲基化发生在对称的CG和CHG位点上。相反，非对称的CHH完全取决于从头甲基化，发生在DNA复制周期后。在植物中，已经确定了有三种不同类别的甲基化转移酶：即甲基转移酶（METs），染色质甲基转移（CMTs），和结构域重排DNA甲基转移酶（DRMs）[11]。MET1（同源的哺乳动物蛋白）催化CG二核苷酸位点发生甲基化[12]。CMT3维持CHG位点的DNA甲基化，它是植物特异性DNA甲基化酶[13]。维持这两种甲基化酶的运作需要激活染色质重塑因子DDM1的活性[14]。另一方面，CHH从头甲基化主要是通过DRM1和DRM2，也有少部分需要CMT2参与。CHH序列中胞嘧啶残基的甲基化经常与基因沉默联系在一起[15]。植物DNA从头甲基化的激活是由利用siRNA靶向DRMs并识别序列特异性位点[16]，从而介导DNA发生甲基化。

2 DNA甲基化的检测方法

近年来，随着分子遗传学实验技术的发展，一些表观遗传学检测技术得到了发展和广泛应用。特别是在DNA甲基化和组蛋白修饰的研究中，实验方法得到了突飞猛进的发展。目前，DNA甲基化修饰的研究技术主要包括：

2.1 限制性内切酶检测法（Southern Blot）

甲基化敏感限制性内切核酸酶（MSREs）是已经发现的320多种限制性内切核酸酶之一，用于鉴定特定序列是否被甲基修饰。这些酶大多数只能切割一个甲基化碱基位点，一些酶可以切割半甲基化（双链中只有一条链被甲基化）位点，一些酶可以切割完全甲基化（双链都被甲基化）位点。然而，5-羟甲基胞嘧啶、糖化5-羟甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶或4-甲基胞嘧啶等却因为它们的结构相似而难以识别。Southern Blot印迹法是最常用的基于此原理的方法[17]。CCGG序列经限制性内切酶HapⅡ和MspⅠ识别，DNA可分别被EcoRⅠ/HapⅡ，EcoRⅠ/MspⅠ酶切。本方法优点是：通过提供待测样品的基因组DNA，无需了解整个DNA序列和详细的一级结构，即可直接对甲基化进行评价和定量分析。

2.2 甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）分析法  MSAP以扩增片段长度多态性（AFLP）技术为基础，用限制性内切酶Hpa II和Msp Ⅰ取代内切酶MseⅠ，用HpaⅡ和MspⅠ识别的5-CCGG序列取代MseⅠ特异性切割的片段。MSAP的实质是用甲基化特异性酶和序列5-CCGG取代AFLP技术中的功能酶和目标条带。MSAP主要包括DNA模板制备、PCR扩增、双酶切和电泳检测。其原理是利用HapⅡ和MspⅠ酶对基因DNA进行双酶切，然后加入与HapⅡ和MspⅠ相对应的限制性内切酶接头，利用接头序列设计引物特异性扩增5-CCGG位点的甲基化片段。HapⅡ和MspⅠ能识别同一位点，但甲基化敏感性不同。因此，扩增结果具有不同的条带，可用于检测基因组DNA的总甲基化水平，区分全甲基化和半甲基化状态[18]。

2.3 亚硫酸氢盐测序法

Frommer等[19]首次提出了亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing，BS）检测5-mC。本方法的基本原理是先用亚硫酸氢盐处理DNA，使未甲基化胞嘧啶C脱氨作用转化为尿嘧啶U，然后设计引物通过PCR扩增目标片段，通过测序可区分5-mC和其他碱基，得到5-mC的位点信息。Bianchessi等[20]利用BS检测血管内皮细胞线粒体DNA非编码区甲基化状态，发现5-mC不是随机分布在DNA非编码区，而是聚集在一起。该方法准确可靠，可检测目标片段中各CpG位点的甲基化状态。然而，该方法样品制备过程复杂，需要大量的克隆和测序，成本较高。

2.4 高效液相色谱法

Kuo等[21]采用反相高效液相色谱法（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）首次检测了小牛胸腺和鲑鱼精DNA中5-mC的含量。这提供了检测整个基因组甲基化水平的典型方法。其主要过程为：利用脱氧核糖核酸酶（DNase1）、核酸酶P1（nuclease P1）和细菌的碱性磷酸酶水解DNA，水解产物经RP-HPLC分离得到5-甲基脱氧胞苷和其他脱氧核苷的峰，进一步计算基因组中5-mC的含量和5-mC与胞嘧啶的比例。Baumer[22]将变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）与PCR相结合，建立了基于异源双链（错配）DNA和同源双链DNA不同解链特征的DHPLC-PCR方法，实现了DNA甲基化檢测的简便、快速方法。随后，随着质谱技术的发展，高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）技术大大提高了5-mC检测的特异性和灵敏度[23]。

3 DNA甲基化在植物应对逆境胁迫中的作用  尽管遗传变异是植物通过长期适应和进化产生新基因的主要来源，但植物表观遗传变化更能使其快速地适应环境的改变。全基因组DNA甲基化图谱在植物发育过程中会不断发生改变，但环境因素也会影响甲基化多样性[24]。许多研究一致认为，不同的环境胁迫，无论是非生物的还是生物的胁迫，都会引起基因组DNA甲基化的改变。甲基化模式的改变又反过来调控植物适应性响应。盐胁迫能够诱导麻疯树叶片和根系的DNA甲基化模式发生改变[25]，这些DNA甲基化的改变可能在耐盐胁迫中发挥重要作用。冷胁迫能够引起玉米幼苗基因组发生DNA去甲基化。DNA去甲基化主要参与转座子激活、激素调节和光合作用等方面的调控。随后，五个基因发生去甲基化并且其转录水平明显增加，从而表明基因的去甲基化是一种快速响应冷胁迫的表观遗传[26]。体外培养的葡萄中DNA甲基化发生改变，当胁迫解除后，观察到40%发生甲基化改变的位点恢复到之前状态，因此作为一个可逆的胁迫适应机制，而60%发生DNA甲基化改变的位点仍维持着甲基化状态，最有可能是继承于有丝分裂[27]。

3.1 DNA甲基化模式與不同基因型抗逆性的关系

同一物种不同基因型的全基因组甲基化的改变与不同程度胁迫之间的联系也经常被探究。许多研究表明植物DNA甲基化能够响应盐和干旱胁迫。例如，三种水稻对盐和干旱的不同敏感性与它们之间存在几个差异甲基化区域有关，其中许多甲基化区域与非生物胁迫应答基因的差异表达有关。研究表明，在干旱条件下，干旱敏感型水稻较耐旱型水稻具有更高甲基化水平[28]。在水稻抗旱品种dk151及其回交亲本IR64中发现基因型特异性DNA甲基化模式。在胁迫恢复后，植株仍然保持着大约30%发生甲基化改变的位点，表明植物可能拥有一种记忆以往不利环境经历的机制。在盐胁迫下，耐盐水稻（Pokkali）和盐敏感水稻（IR29）中甲基化的可变性不同。在盐胁迫条件下，耐盐水稻比盐敏感水稻的DNA甲基化改变能力强[29]。对两个具有不同耐盐性的小麦品种进行了研究，结果表明耐盐小麦比的盐敏感小麦的DNA甲基化水平高。盐胁迫下，两种品种中全基因组都发生了低甲基化。与之研究一致的是，在小麦耐盐品种SR3和其祖先亲本JN177有不同的DNA甲基化水平，盐胁迫后两个品种的DNA甲基化水平均降低。这些结果强调，DNA甲基化模式的变化可以被看作是植物对胁迫的普遍响应。此外，体细胞杂交诱导的甲基化改变可以增强SR3的耐盐碱性[30]。

3.2  具有特异性的胁迫响应基因的DNA甲基化变化  大量研究表明，特定基因的DNA甲基化的动态变化直接参与不同胁迫应答的调控。以烟草和烟草花叶病毒之间发生的植物病原体相互作用为例，是由于DNA发生去甲基化激活防御基因。在感染期间，NtAlix1的低甲基化增强了这种病原体响应基因的表达量[31]。在同一植物–病原体相互作用中，可以抵制烟草花叶病毒侵染的N基因发生了CG低甲基化[32]。

已经报道过许多研究关于在非生物胁迫下，DNA甲基化水平和特定胁迫应答基因表达量的变化。烟草在不同的胁迫下，包括铝、盐、活性氧、低温，会导致甘油磷酸二酯酶基因（NtGPDL）甲基化水平的变化。尤其是NtGPDL的GC位点在编码区和启动子发生去甲基化。因此，NtGPDL被诱导表达。这些结果表明在非生物胁迫下甲基化和NtGPDL表达量的关系[33]。与之研究结果一致的是，用DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷处理水稻后，其氧化应激相关基因表达上调导致对盐胁迫的耐受性增强[34]。同样，在烟草中过表达拟南芥ROS1基因可以降低类黄酮和抗氧化途径基因的启动子区和编码区的甲基化水平。由于提高了这些基因表达水平导致转基因烟草具有更强的盐胁迫耐受能力[35]。在玉米幼苗中，盐胁迫使蛋白磷酸酶2C（zmPP2C）第一内含子和谷胱甘肽S-转移酶（zmGST）发生甲基化改变。盐胁迫诱导拟南芥zmPP2C内含子的高甲基化导致其表达量下降。另一方面，盐胁迫诱导zmGST发生去甲基化从而使基因表达量升高[36]。在小麦中，盐胁迫诱导了24个基因启动子区和编码区DNA甲基化发生改变，但只有启动子区DNA甲基化的变化与基因表达的改变有关。在盐胁迫下两个发生甲基化和表达改变的基因，即TaFLSl基因编码一种黄酮醇合成酶和TaWRSI5编码一种蛋白酶抑制剂，能提高拟南芥的耐盐性[30]。

在两个具有不同抗旱性小麦品种中，盐胁迫诱导胞浆中3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPC）的表达，它编码一种在植物应激反应中起积极作用的蛋白质[37]。但抗性品种的转录水平高于易感品种。耐旱品种中盐胁迫诱导GAPC基因启动子区的CG和CHG位点发生去甲基化;另一方面，在对干旱敏感品种中盐胁迫不影响CG区域甲基化状态但提高了GAPC基因启动子区CHG和CHH的甲基化水平。在胁迫响应过程中，两个品种的小麦GAPC基因启动子区发生了不同类型和不同水平的甲基化改变，说明应激反应中的启动子甲基化和基因表达具有一定的关系[38]。番茄植株在干旱条件下，脱落酸-胁迫-成熟响应蛋白1（Abscisic Acid Stress Ripening1）的CHH位点发生低甲基化，同时诱导其表达量增加，从而增强了其适应环境能力[39]。脱落酸增强了浮萍的抗冷能力是通过改变甲基化状态从而影响ATP酶基因的表达[40]。用亚硫酸氢钠甲萘醌处理拟南芥植物，能够激活拟南芥对生物和非生物胁迫的响应[41]，使脯氨酸代谢相关基因甲基化状态发生改变。ERD5和P5CS1在CHG和CHH区域的甲基化改变，参与脯氨酸的生物合成和降解，诱导这两个基因的表达升高并促进脯氨酸的积累，从而在抗逆性中发挥作用[42]。

在青蒿中，紫外光照射能够诱导青蒿素生物合成途径中的关键酶DBR2基因启动子区4个CG，4个CHH和2个CHG位点发生去甲基化。分析显示这个基因启动子甲基化状态的变化涉及七个转录因子结合位点，其中包括青蒿素生物合成的正调节WRKYs。总之，UV-B诱导DBR2基因的过表达从而使青蒿素积累。这些数据表明，在植物对UV-B辐射的响应中，DNA甲基化是一种重要的表观遗传[43]。

参 考 文 献

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（責任编辑：夏剑萍）