长链非编码RNA NEAT1在银屑病中的表达及其与疾病活动度和炎症因子水平的关联分析

金 曌， 李聪慧， 程 杨， 苏 慧， 付 霆

银屑病是一种多基因遗传背景下自身免疫紊乱导致的炎性皮肤病，在中国其总患病率约为0.47%，男女患病率无差异[1-4]。由于银屑病病程长、易复发及难以治愈等特点，患者的预后仍然不容乐观。因此亟需寻找与银屑病患病风险和疾病活动度有关的生物标记物来监测患者病情和改善患者的预后。长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)核富集转录本1(nuclear enriched abundant transcript 1, NEAT1)在免疫性疾病系统性红斑狼疮患者单核细胞中过表达，且与疾病活动度、炎症因子表达量呈正相关；在骨关节炎患者中，lncRNA NEAT1的过表达和滑膜细胞的增生、炎症因子表达量上调有关[5-6]。这些研究表明，lncRNA NEAT1在炎症性疾病发生和进展过程扮演着重要角色。银屑病作为一种典型的炎症性皮肤病，lncRNA NEAT1也可能参与其发生、发展过程。本研究旨在评估lncRNA NEAT1在银屑病患者病变皮肤组织中的表达水平以及其与疾病严重程度和炎症因子水平的关联。

1 对象与方法

1.1对象 收集2016年7月—2018年6月笔者医院就诊的银屑病患者204例，男性122例，女性82例，年龄(46.4±12.4)岁(34～58.8岁)，体质量指数(body mass index, BMI)为(23.6±4.1)kg/m2(19.5～27.7 kg/m2)，病程、受累体表面积(body surface area, BSA)和银屑病皮损面积及严重度指数(psoriasis area and severity index, PASI) 中位数分别为10.0年(5.0～14.8)年、19.0%(16.0%～22.0%)和8.4(6.8～12.1)。纳入标准：(1)按照《中国临床皮肤病学》中银屑病的临床诊断标准诊断为银屑病[7]；(2)年龄>18岁；(3)同意钻取皮肤病变组织及附近非病变组织。排除标准：除银屑病以外别的皮肤炎症疾病，或伴随其他系统性免疫疾病，如类风湿关节炎、红斑狼疮。所有银屑病患者均位于进展期，其中寻常型181例、关节型12例、局限性脓疱型6例及红皮型5例。共有186例(91.2%)，172例(84.3%)，140例(68.6%)和22例(10.8%)患者正在接受局部治疗、光疗、系统性非生物制剂治疗和系统性生物制剂治疗。本研究获得笔者医院伦理委员会批准，所有纳入研究的患者均签署知情同意书。

1.2数据收集 患者纳入研究后，记录患者的年龄、性别、BMI、病程、银屑病受累BSA并评估PASI评分；此外，记录患者正在使用的药物类型以排除药物对lncRNA NEAT1水平的影响。

1.3标本获取及保存 患者纳入研究后，钻取3 mm深度银屑病病变组织标本，并同时钻取病变5 cm外的配对正常皮肤组织标本，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.4定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)检测 采用qPCR检测病变组织及配对正常皮肤组织的lncRNA NEAT1表达量，并检测病变组织标本的肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)、IL-8、IL-17和IL-22 mRNA的表达量。qPCR具体操作如下：采用TRIzol (美国Invitrogen公司)提取组织总RNA后，采用PrimeScript RT reagent (日本Takara公司)进行RNA的逆转录，采用One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (日本Takara公司)进行qPCR定量检测。以GAPDH作为内参，并采用2-△△Ct法计算目标基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 qPCR引物设计

lncRNA：长链非编码RNA；NEAT1：核富集转录物1；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL：白细胞介素.

2 结 果

2.1lncRNA NEAT1的表达量 lncRNA NEAT1的表达量在正常皮肤组织和病变皮肤组织中的中位值分别为1.442(0.667～2.324)和3.014(1.498～4.960)。与正常皮肤组织比较，lncRNA NEAT1表达量在病变组织中明显偏高(P<0.001，图1A)。用于鉴别银屑病病变皮肤组织和正常皮肤组织的ROC曲线下面积(area under curve, AUC)为0.747(95%CI：0.700～0.794)，以最佳切割点lncRNA NEAT1的表达量2.077为阈值时(最佳切割点定义为敏感度和特异度之和最大的点)，区别银屑病病变皮肤组织和正常皮肤组织的敏感度为66.7%，特异度为72.5%(图1B)，表明lncRNA NEAT1的表达量可以很好地区分银屑病病变皮肤组织和正常皮肤组织。

2.2lncRNA NEAT1表达量与患者临床特征的关联 银屑病患者病变皮肤组织lncRNA NEAT1表达量与PASI评分呈正相关(r=0.275,P<0.001,表2)。此外，病变皮肤组织lncRNA NEAT1的表达量与患者年龄、性别、BMI、病程、受累BSA和治疗方式均无关(表2，3)。进一步分析不同银屑病分型与长链非编码RNA NEAT1的关系，发现长链非编码RNA NEAT1与不同银屑病分型无显著差异(P=0.094，表4)。

2.3PASI评分的关联因素分析 采用单元线性回归分析PASI评分的关联因素，结果显示病变皮肤组织lncRNA NEAT1表达量(P=0.001)、年龄(P=0.014)、受累BSA(P<0.001)和局部治疗(P=0.005)均与PASI评分呈正相关。进一步采用多元线性回归模型分析PASI评分的关联因素，结果显示病变皮肤组织lncRNA NEAT1(P=0.014)、受累BSA(P<0.001)和局部治疗(P=0.008)均与PASI呈独立正相关。其他临床病理特征和PASI评分的关联详见表5。

表2 病变皮肤组织lncRNA NEAT1表达量和患者临床特征(连续变量)的关联

Tab 2 Association between lncRNA NEAT1 relative expression in psoriatic lesions and clinical characteristics (continuous variable) of psoriatic patients

临床特征(连续变量)lncRNA NEAT1表达量rP年龄0.072BMI0.058病程0.038受累BSA0.111PASI评分0.275<0.001

lncRNA：长链非编码RNA；NEAT1：核富集转录物1；BMI：体质量指数；BSA：体表面积；PASI：银屑病皮损面积及严重度指数.

2.4lncRNA NEAT1表达量与炎症因子mRNA表达量的关联 病变组织炎症因子TNF-α，IL-6，IL-8，IL-17和IL-22 mRNA的表达量分别为2.223(1.417～2.985),1.736(1.086～2.521),2.529(1.504～3.750),2.397(1.610～3.417)和2.782(1.642～4.220)。银屑病患者病变皮肤组织lncRNA NEAT1的表达量与TNF-α mRNA(r=0.342，P<0.001)、IL-6 mRNA(r=0.315，P<0.001)、IL-8 mRNA(r=0.174，P=0.013)、IL-17 mRNA(r=0.345，P<0.001)和IL-22 mRNA(r=0.146，P=0.037)表达量均呈正相关(表6)。

表3 病变皮肤组织lncRNA NEAT1表达量和患者临床特征(分类变量)的关联

Tab 3 Association of lncRNA NEAT1 relative expression in psoriatic lesions with clinical characteristics (classified variable) of psoriatic patients

临床特征(分类变量)lncRNA NEAT1表达量性别 女3.470(2.029～5.630) 男2.658(1.185～4.763)局部治疗 无2.727(1.517～4.724) 有3.068(1.482～4.969)光疗 无3.678(1.652～5.942) 有2.942(1.302～4.889)系统性非生物制剂治疗 无3.338(1.743～5.262) 有2.893(1.302～4.889)系统性生物制剂治疗 无2.931(1.445～5.103) 有3.544(1.646～4.592)

3 讨 论

lncRNA NEAT1是从染色体11q13.1转录而来的，它含有两种单体形式，分别是NEATI-1(3.7 kb)和NEATI-2(23 kb)，且被认为是病毒诱导的非编码RNA[8-12]。最近的研究表明，lncRNA NEAT1与多种免疫性和炎症性疾病的生物学活动密切相关。研究发现，lncRNA NEAT1 在系统性红斑狼疮中通过调节丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的下游，促进Toll样受体(TLR4)介导的炎症反应过程[6]。另一研究发现，lncRNA NEAT1在骨关节炎中滑膜细胞增生过程中可以抑制miR-181c的表达，从而促进骨桥蛋白表达和滑膜细胞增生，骨桥蛋白再参与调节多种促炎因子(例如IL-6和IL-8)的表达[5]。此外，lncRNA NEAT1还被发现在动脉粥样硬化中受低密度脂蛋白诱导，参与亚核结构paraspeckle的形成，继而paraspeckle通过核因子(nuclear factor-κB，NF-κB)和 p38 信号通路，参与巨噬细胞主导的炎症和脂质的摄取[13]。以上研究表明，lncRNA NEAT1间接或直接调控炎症反应，从而促进了免疫性或炎症性疾病的发生或进展过程。临床研究发现，在骨关节炎患者退化的滑膜组织中，lncRNA NEAT1 被发现表达量上调[5]。此外，在系统性红斑狼疮患者血液单核细胞中lncRNA NEAT1也高表达，且与疾病活动度呈正相关[6]。鉴于银屑病是以高度炎症为特征的自身免疫性皮肤病，笔者假设lncRNA NEAT1也与银屑病的发病机理和进展过程有关。因此，笔者比较了银屑病患者病变皮肤组织和配对正常皮肤组织中lncRNA NEAT1的表达量，结果表明lncRNA NEAT1在银屑病患者病变皮肤组织中的表达量明显高于正常皮肤组织，且ROC曲线结果显示lncRNA NEAT1高表达可以用来很好地区分银屑病病变皮肤组织和正常皮肤组织。关联分析表明，lncRNA NEAT1表达量和银屑病疾病活动度呈正相关，进一步的多元线性回归分析表明病变皮肤组织lncRNA NEAT1表达量与疾病活动度呈独立正相关。这些结果可能的原因是：(1)lncRNA NEAT1可能在真皮层自体免疫细胞中通过结合核内蛋白PSPC1、SFPQ或p54nrb组成paraspeckle结构，继而paraspeckle通过多种炎症通路(如MAPK、NF-κB)促进真皮层自体免疫细胞分泌多种炎症因子(包括TNF-α，IL-6，IL-8 和IL-1β等)，导致炎症反应增强，因而临床表现为银屑病的活动度更高；(2)lncRNA NEAT1可能直接参与调控炎症反应相关通路，诱导炎症反应增强，使银屑病患者的疾病活动度升高[5-6,13-15]。

表4 不同银屑病分型和病变组织lncRNA NEAT1相对表达量的关联

lncRNA：长链非编码RNA； NEAT1：核富集转录物1； BMI：体质量指数；BSA：体表面积.

表5 PASI评分的关联因素(线性回归分析)

Tab 5 Factors affecting PASI score by linear regression analysis

炎症因子mRNA相对表达量lncRNA NEAT1相对表达量rPTNF-α mRNA0.342<0.001IL-6 mRNA0.315<0.001IL-8 mRNA0.1740.013IL-17 mRNA0.345<0.001IL-22 mRNA0.1460.037

PASI：银屑病皮损面积及严重度指数； lncRNA：长链非编码RNA； NEAT1：核富集转录物1；IL：白细胞介素;TNF-α：肿瘤坏死因子-α.

表6 病变皮肤组织lncRNA NEAT1表达量和炎症因子mRNA相对表达量的关联

Tab 6 Association between lncRNA NEAT1 relative expression of psoriatic lesions and relative expression of inflammatory cytokine mRNA

炎症因子mRNA相对表达量lncRNA NEAT1相对表达量rPTNF-α mRNA0.342<0.001IL-6 mRNA0.315<0.001IL-8 mRNA0.1740.013IL-17 mRNA0.345<0.001IL-22 mRNA0.1460.037

lncRNA：长链非编码RNA；NEAT1：核富集转录物1；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL：白细胞介素.

文献报道，TNF-α，IL-6，IL-8，IL-17和IL-22与银屑病疾病进展非常相关[3,16]。因此，为进一步确定lncRNA NEAT1与银屑病炎症的关系，本研究检测了银屑病患者病变皮肤组织中TNF-α，IL-6，IL-8，IL-17和IL-22水平，并与lncRNA NEAT1在病变皮肤组织中表达量做关联分析，结果显示病变皮肤组织中lncRNA NEAT1表达水平与TNF-α，IL-6，IL-8，IL-17和IL-22水平呈正相关，表明lncRNA NEAT1可能是通过促进炎症反应来加重患者的疾病活动度，这可能与其在系统性红斑狼疮或动脉粥样硬化中的促炎作用类似。lncRNA NEAT1通过直接调控炎症反应相关通路，如诱导MAPK途径激活来促进TLR4介导的炎症反应过程，从而诱导促炎因子的表达。此外，lncRNA NEAT1也可以通过形成paraspeckle，间接参与调控炎症反应相关通路，比如NF-κB或 p38，继而诱导促炎因子的表达[5-6,14-16]。

本研究不足之处：(1) 未深入评估lncRNA NEAT1影响银屑病患者炎症水平和疾病活动度的机制；(2) 研究样本来自单中心且样本量较小，可能造成患者选择偏倚和统计效能下降；(3) 未评估lncRNA NEAT1在银屑病患者转归中的作用。