自体血清与小牛血去蛋白眼用凝胶治疗兔角膜碱烧伤的比较

王 健，解正高，陈 放，朱 俊，杜 伟

目的：通过建立兔角膜碱烧伤模型，比较自体血清与小牛血去蛋白眼用凝胶在兔角膜碱烧伤治疗中的效果。

方法：制作兔右眼角膜碱烧伤模型30眼，造模后碱烧伤分度全部为Ⅲ度烧伤，将其随机分为三组，分别采用生理盐水、小牛血去蛋白眼用凝胶及自体血清滴眼液4次/d，各组滴阿托品眼用凝胶1次/晚，氧氟沙星眼用凝胶1次/晚，连续2wk。治疗7、14d后观察角膜新生血管形态并计算面积；第14d处死各组实验动物后，摘除双眼角膜，其中左眼为正常对照，右眼为实验眼，分别进行常规组织病理学检查，角膜组织匀浆内CD45、IL-10、IFN-γ及VEGF浓度测定。

结果：治疗7、14d后小牛血去蛋白眼用凝胶组角膜新生血管面积(29.48±2.27、34.19±2.67mm2)与自体血清组(34.19±2.67、33.89±2.74mm2)无差异(P>0.05)。治疗14d角膜组织匀浆测定：小牛血去蛋白眼用凝胶组(0.56±0.04ng/mL)和自体血清组(0.54±0.05ng/mL)CD45含量均小于生理盐水组(1.27±0.07ng/mL)(P<0.05)； 自体血清组(452.49±11.40pg/mL)和小牛血去蛋白眼用凝胶组(332.49±13.67pg/mL)IL-10含量均大于生理盐水组(111.05±6.95pg/mL)(P<0.05)；小牛血去蛋白眼用凝胶组(23.20±2.89pg/mL)和自体血清组(22.61±2.72pg/mL)IFN-γ含量均小于生理盐水组(41.77±4.26pg/mL)(P<0.05)；小牛血去蛋白眼用凝胶组(151.14±18.21pg/mL)和自体血清组浓度(149.11±14.75pg/mL)VEGF含量均小于生理盐水组(391.35±28.59pg/mL)(P<0.05)。

结论：兔角膜碱烧伤后抑制炎症因子CD45、IFN-γ及VEGF释放及抑制角膜新生血管形成方面，自体血清与小牛血去蛋白眼用凝胶作用相当；在促进抗炎因子IL-10释放、抑制炎症细胞浸润方面，自体血清作用强，小牛血去蛋白眼用凝胶次之。

0 引言

眼化学伤的发生约占眼外伤的10%左右，占整个工业性危害的5%～20%[1]。在各种化学伤中酸烧伤及碱烧伤占据主要地位，其中碱烧伤又因其病理机制复杂，并发症较多，预后较差，病程较长成为一类较为棘手的眼科疾病。角膜碱烧伤发生后，严重者留有永久视力损害，更甚者可以发生角膜溃疡、角膜穿孔、角膜白斑、干眼、睑球粘连、并发性白内障、继发青光眼、全眼球炎及眼球萎缩等[2],是临床常见的致盲原因之一。

碱性物质具有强烈的刺激性和腐蚀性，其对角膜组织的损伤机制为：(1)碱性物质与组织接触后形成可溶于水的碱-变性蛋白复合物，皂化脂肪组织，从而发生组织液化性坏死，使碱性物质迅速向四周及深部组织扩散，腐蚀眼内其他组织，严重者可以损伤眼底等深部组织[3-4]。(2)碱烧伤后发生的炎症反应导致大量多核白细胞向创口移行浸润，而后释放大量胶原酶及蛋白酶，进而使得胶原组织溶解，导致角膜溃疡，严重者形成角膜穿孔[5]。(3)中性粒细胞的组织内的浸润使得自由基产生增加，导致细胞膜的通透性增强，从而使得组织损害进一步加重。此三种机制相互联系，相互促进，从而导致角膜损坏的恶性循环[6-7]，轻者形成角膜云翳，严重者发生角膜白斑、无菌性角膜溃疡、穿孔、睑球粘连及继发青光眼等，留有永久性视力损害，严重者甚至无法保全眼球，导致失明。

目前角膜碱烧伤的药物治疗主要有[2]：局部使用抗生素、散瞳、降眼压、肝素、胶原酶抑制剂、维生素C，枸橼酸钠、免疫抑制剂、表皮生长因子、纤维连接蛋白、基质金属蛋白酶抑制剂、转化因子-β、皮质类固醇激素、自体血清等。自体血清自1984年，Fox等[8]首先报道将自体血清用于治疗眼表疾病，其后广泛应用。小牛血去蛋白眼用凝胶其主要成分为20%小牛血去蛋白提取物，基质为卡波姆，含有多种游离氨基酸，低分子肽和寡糖，可以改善线粒体的呼吸功能[9]，增强细胞对葡萄糖及氧的利用，改善微循环及组织营养，促进ATP合成。小牛血去蛋白提取物眼用凝胶还能阻止碱烧伤组织的继发损害，防止损伤范围扩大与加深，促进角膜损伤的修复[10]。此外，其基质主要为卡波姆，有黏附性，能在局部形成保护膜，对受损角膜起保护作用，同时可以使得药效更持久[11]。二者在各类原因所致的角膜上皮缺损的治疗中应用广泛，已有大量临床文献报道，但二者在角膜碱烧伤中的疗效比较鲜有报道，尤其是在动物实验方面。

本实验以兔角膜碱烧伤为实验模型，分别观察局部使用自体血清、小牛血清去蛋白眼用凝胶及生理盐水等滴眼后兔角膜碱烧伤的角膜组织病理学改变、角膜新生血管情况及炎症因子浓度，分析不同组别在角膜碱烧伤治疗过程中疗效的差异。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 实验动物 健康大耳白兔30只(由扬州大学医学院实验动物中心提供)，体质量2.0～2.5kg，雄雌不限，眼部检查无异常。实验方案获院伦理委员会审批通过。30只兔角膜碱烧伤造模并进行烧伤分度全部为Ⅲ度后通过随机数字表法分为3组，生理盐水组，小牛血去蛋白眼用凝胶组、自体血清组。每组各10只，每组各只兔分别编号(组号-个号)。

1.1.2主要试剂及仪器 小牛血去蛋白眼用凝胶、阿托品凝胶、氧氟沙星眼膏(沈阳兴齐制药有限公司)，兔自体血清滴眼液(自制)，兔白细胞共同抗原(CD45)、兔γ干扰素(IFN-γ)、兔白细胞介素-10(IL-10)、兔血管内皮细胞生长因子(VEGF)酶联免疫吸附测定试剂盒(上海瑶韵生物科技股份有限公司)。眼前节照相机(科林公司)，Image-Pro PLUS 6.0图像处理软件(Media Cybernetics 公司)，扫描电镜(美国FEI公司,XL-30)，酶标仪(瑞士TETCAN公司，TECAN SUNRISE)。

1.2方法

1.2.1建立兔角膜碱烧伤模型 将眼部检查无异常的大耳白兔30只，每只右眼用0.5%盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉3次，每次间隔2min。开睑器开睑，无菌生理盐水冲洗结膜囊，以灭菌棉签擦干结膜囊，将直径为8mm的灭菌滤纸片浸入1.0mol/L的NaOH溶液中饱和后吸去多余碱液，后将滤纸片置于兔右眼中央角膜表面1min后取出，立即用灭菌生理盐水连续冲洗5min，形成边界清晰的圆形白色烧伤区域，制作成兔角膜碱烧伤动物模型。依据Hughes分度法为中度碱烧伤[12]。依据我国1982年眼外伤与职业性眼病协作小组通过的分度标准[1]为Ⅲ度烧伤。

1.2.2制作兔自体血清滴眼液 于角膜碱烧伤造模分组后将自体血清组各只实验兔，用离心管分别采集各兔两耳耳缘静脉血约10mL，置清洁无菌离心试管中，室温下静置2h后以3000r/min离心10min，取上清血清液分别注入有各只实验兔对应标号的2只无菌滴眼液空瓶中，置于4℃冰箱内避光保存备用。1wk后弃去先使用的第1支残液，使用第2支自体血清。

1.2.3给药方式 各组实验兔右眼造模后分别以无菌生理盐水滴眼液、小牛血去蛋白眼用凝胶、自体血清滴眼液滴右眼，每次2滴，每次停留30s以上，4次/d；同时所有实验兔右眼每晚使用阿托品凝胶及氧氟沙星眼膏涂眼1次，连续14d。

1.2.4测定角膜新生血管面积 将所有实验白兔按组及编号分别于造模后7、14d裂隙灯下观察角膜4个象限最长一支新生血管长度、累及角膜缘钟点数等情况，按文献公式进行计算各象限新生血管面积(CRNV)。公式：A=C/12×3.1416[r2-(r-l)2]。C为CRNV累及角膜圆周钟点数，l为所取血管长度，r为兔角膜半径6.75mm，总面积等于4个象限之和。

1.2.5测定角膜组织匀浆CD45、IL-10、IFN-γ及VEGF含量 第14d用空气栓塞法处死各组实验动物，摘取双眼，每组左眼作为健眼对照。按编号分别取部分角膜组织，用预冷的0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)冲净残留其上的血液，称量后将组织剪碎。将剪碎的角膜组织与PBS按 m(角膜组织)∶V(PBS)=1∶9 的比例加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。对匀浆液进行超声破碎。将匀浆液于5000×g离心10min，取上清使用IL-10、CD45、IFN-γ及VEGF的ELISA试剂盒按步骤进行检测。

1.2.6角膜组织病理学检查 将摘除的各组及随机摘取的健眼部分角膜，常规甲醛固定，石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色，100倍显微镜下进行组织学观察。

2 结果

2.1治疗7d和14d后三组兔角膜新生血管面积比较 治疗7、14d后三组兔角膜新生血管面积比较差异均有统计学意义(P=0.001)。治疗7、14d后小牛血去蛋白眼用凝胶组、自体血清组新生血管面积均小于生理盐水组，差异均有统计学意义(P<0.05)；小牛血去蛋白眼用凝胶组与自体血清组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、2。

2.2治疗14d后三组兔角膜组织匀浆CD45、IL-10、IFN-γ及VEGF含量比较 治疗14d后三组兔角膜组织匀浆CD45、IL-10、IFN-γ及VEGF含量比较差异均有统计学意义(P=0.001)。CD45含量小牛血去蛋白眼用凝胶组、自体血清组小于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)；IL-10含量自体血清组大于小牛血去蛋白眼用凝胶组和生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)；IFN-γ含量小牛血去蛋白眼用凝胶组、自体血清组小于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)；VEGF含量小牛血去蛋白眼用凝胶组、自体血清组小于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)，表3、4。

2.3治疗14d后角膜组织病理学检查 正常角膜组：角膜上皮完整，基质纤维排列规则，无水肿及充血，无炎性细胞浸润；生理盐水组：角膜上皮断裂，基质纤维排列不规则，基质纤维水肿及大量炎性细胞浸润；小牛血去蛋白眼用凝胶组：角膜上皮完整，基质纤维排列基本规则，基质纤维轻度水肿及中等量炎性细胞浸润；自体血清组：角膜上皮完整，基质纤维排列基本规则，基质纤维轻度水肿及少量炎性细胞浸润，见图1。

3 讨论

角膜化学烧伤严重危害眼组织，临床上除早期的急诊相关处理外，多采取抗炎、抑制免疫反应[13]、角膜移植术、基因治疗等手段，治疗效果各有优缺点[14]，而角膜组织修复也是疾病药物治疗的关键环节，维持及恢复角膜表层及内皮层的正常细胞代谢是角膜损伤愈合的先决条件。化学致伤物的种类、化学性质、物理性质、穿透组织的能力、浓度、接触时间和面积，伤后是否接受合理的急救处理等因素影响化学性眼表烧伤的程度和预后。角膜碱烧伤比酸烧伤严重，主要因为其病理机制复杂，并发症多，预后最差[15]，不仅是眼科的急症重症，也是眼科的疑难病症，是眼部致残致盲的常见原因之一。

分组治疗7d治疗14d生理盐水组46.18±3.6949.24±3.83小牛血去蛋白眼用凝胶组29.48±2.2734.19±2.67自体血清组34.19±2.6733.89±2.74 F56.63141.519P0.0010.001

小牛血清去蛋白眼用凝胶是小牛血清去蛋白提取物的眼用制剂，主要含有无机离子(K+、Cl-、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+等)及氨基酸、小分子肽、核苷酸、低聚糖、脂类等小分子有机物，其中的小分子活性物质能改善组织细胞对氧和葡萄糖的摄取及利用，还能促进成纤维细胞和内皮细胞的游走和增生，因而能够促进创伤愈合[16-17]。有研究表明在角膜碱烧伤的药物治疗中，其能阻止角膜继发性损害，从而防止组织损伤范围扩大及加深，促进损伤角膜组织的修复[10]。同时它不含蛋白，较少引起过敏。此外，其基质主要为卡波姆，有黏附性，能在局部形成保护膜，对受损角膜起保护作用，同时可以使得药效更持久[11]。

自体血清即从患者自己的血液中所提取的血清，去除了血液中的细胞成分和凝血因子，含有氨基酸、维生素、无机盐、脂质，蛋白质以及大量的活性因子。包含了几乎所有生理泪液的成分，与泪液的生物力学和生物化学特性也较为相似[18]，pH值和渗透压也相近，其中纤维连接蛋白，维生素A以及表皮生长因子含量甚至高于正常泪液[18]。1984年，Fox等[8]首先报道将自体血清用于治疗眼表疾病。自体血清为自身来源，无过敏反应，机体耐受性较好，患者使用需要采集自身血液。临床使用过程中需要注意只能采集碱烧伤后1wk内的血清方可使用，因为1wk后机体产生自身抗体，反而不利于组织修复。碱烧伤后角膜中蛋白变性而成为抗原，扩散进入角膜和结膜组织，由于该区域具有“局部淋巴结”作用而产生免疫应答，同时抗原通过角结膜血管进入血液循环或淋巴循环，进而刺激机体免疫器官产生相应抗体[2]。

实验研究表明：(1)角膜新生血管面积形成方面：正常角膜内无血管是维持角膜组织透明及免疫赦免的必要条件，缺氧、炎症、感染及外伤等均可诱发角膜新生血管。角膜碱烧伤易诱导新生血管形成[19-20]。角膜碱烧伤后新生血管为形成因子与抑制因子平衡失调的结果，角膜内调节因子在角膜新生血管形成中具有重要作用[21],新生血管虽可促进组织修复，但会影响角膜透明度，最终影响视功能[22]。VEGF是目前确定的一种最直接的新生血管形成因子，碱烧伤后角膜组织内大量VEGF表达使血管内皮细胞分裂、增生和迁移，毛细血管基底膜发生降解，形成新生血管腔。治疗7、14d后小牛血去蛋白眼用凝胶组、自体血清组新生血管面积小于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)。小牛血去蛋白眼用凝胶组组、自体血清组角膜新生血管面积相当，显著小于生理盐水组，主要是因为二者都含有来源于血液中的大量有效的活性成分，能够抑制角膜炎症及减少新生血管形成。(2)角膜组织匀浆CD45、IL-10、IFN-γ及VEGF浓度：治疗14d角膜匀浆测定：CD45浓度小牛血去蛋白眼用凝胶组组、自体血清组小于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)；IL-10浓度自体血清组大于小牛血去蛋白眼用凝胶组大于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)；IFN-γ浓度小牛血去蛋白眼用凝胶组、自体血清组小于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)；VEGF浓度小牛血去蛋白眼用凝胶组、自体血清组小于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)。角膜碱烧伤后炎症反应在角膜组织损伤中起着重要的作用，其中各种炎症因子又在这一过程中发挥重要的作用。CD45是位于白细胞表面的白细胞共同抗原(LCA)，高水平表达在除红细胞和血小板之外的多有造血细胞上。在B细胞和T细胞的不同发育阶段，CD45参与多种免疫功能[23]。IFN-γ具有抗病毒、免疫调节及抗肿瘤特性，同时还能促成自身免疫。碱烧伤后两组CD45及IFN-γ浓度小于生理盐水组，表明自体血清与小牛血去蛋白眼用凝胶组在炎症因子形成释放过程中有一定抑制作用。IL-10是一种多细胞源、多功能的细胞因子，调节细胞的生长与分化，参与炎性反应和免疫反应，是目前公认的炎症与免疫抑制因子，能够抑制巨噬细胞释放炎症介质。Sotozono等[24]研究发现，角膜碱烧伤后IL-1,IL-6,IL-10,TNF-α的mRNA表达增高。IL-10浓度自体血清组最高，小牛血去蛋白眼用凝胶组次之，表明自体血清在抑制炎症过程中能够促进淋巴细胞释放抑制炎症的因子，其效果优于小牛血去蛋白眼用凝胶组。VEGF是一种很强的内皮细胞有丝分裂原，可增加血管的通透性，刺激血管内皮细胞的增殖[25]，是目前确定的一种最直接的新生血管形成因子,其过度表达和新生血管形成密切相关[26]。新生血管一方面可以促进角膜修复，但也可以影响角膜透明度。在各组中自体血清组与小牛血去蛋白眼用凝胶组VEGF浓度较低，这与二者角膜新生血管面积有对应关系。有报道提示抑制VEGF的表达可以抑制角膜新生血管形成[27-28]。(3)角膜组织病理学方面：治疗14d角膜常规病理检查：正常角膜组，角膜上皮完整，基质纤维排列规则，无水肿及充血，无炎性细胞浸润；碱烧伤后角膜上皮断裂，基质纤维排列紊乱，基质纤维水肿及炎性细胞浸润。治疗14d后自体血清组与小牛血去蛋白眼用凝胶组二者比较，上皮基本修复，基质纤维排列较其规则，炎症细胞浸润较少，炎症细胞较少可使得自由基产生减少，减少胶原溶解，从而减轻组织炎症反应。

图1 各组角膜组织病理学检查图片(HE×100) A:正常角膜组;B:生理盐水组;C:小牛血去蛋白眼用凝胶组;D:自体血清组。

表2 治疗7d和14d后三组兔角膜新生血管面积组间两两比较统计值

组间两两比较治疗7dtP治疗14dtP生理盐水组vs小牛血去蛋白眼用凝胶组16.70330.00115.2130.001生理盐水组vs自体血清组17.18830.00115.3780.001小牛血去蛋白眼用凝胶组vs自体血清组0.4850.9620.1650.996

分组CD45(ng/mL)IL-10(pg/mL)IFN-γ(pg/mL)VEGF(pg/mL)生理盐水组1.27±0.07111.05±6.9541.77±4.26391.35±28.59小牛血去蛋白眼用凝胶组0.56±0.04332.49±13.6723.20±2.89151.14±18.21自体血清组0.54±0.05452.49±11.4022.61±2.72149.11±14.75 F402.0941733.607101.638219.863P0.0010.0010.0010.001

表4 治疗14d后三组兔角膜组织匀浆CD45、IL-10、IFN-γ及VEGF含量两两比较统计值

组间两两比较CD45tPIL-10tPIFN-γtPVEGFtP生理盐水组vs小牛血去蛋白眼用凝胶组0.71<0.001221.43<0.00118.56<0.001240.21<0.001生理盐水组vs自体血清组0.73<0.001341.44<0.00119.161<0.001242.24<0.001小牛血去蛋白眼用凝胶组vs自体血清组0.010.576120.00<0.0010.590.7532.030.997

根据文献报道使用自体血清时应注意时机，应使用伤后1wk内的血清[2]。刘春明[29]实验证明碱烧伤7d后自体血中可以检测出抗体，5～6wk达高峰，随后逐渐下降。在抑制炎症因子释放、角膜新生血管形成、抑制炎症细胞浸润方面，自体血清与小牛血去蛋白眼用凝胶作用相当。因此，在碱烧伤治疗的早期，如果能够采集自体血清用于治疗效果较为理想，其富含多种营养物质，在角膜上皮及基质修复方面有良好效果，不仅能有效降低泪液中炎症因子浓度[30]，同时还能降低角膜组织中炎症因子浓度。自体血清采集时注意无菌，以减少污染可能，根据Tsubota等[31]研究在4℃避光保存1mo及-20℃保存3mo时其主要有效成分(EGF，维生素A，TGF-β)浓度无显著改变。关于自体血清不同浓度的对比研究较少，有报道高浓度可能效果更好[32]。如果没有条件使用或伤后已逾1wk则优先考虑使用小牛血去蛋白眼用凝胶。本研究着重观察了在角膜碱烧伤后早期自体血清与小牛血去蛋白眼用凝胶二者主要区别，未能对中晚期疗效进行全面比较，有待进一步研究。