MicroRNA-34a通过上调Cdc42和Rac1促进人晶状体上皮细胞衰老和凋亡

兰 文，陈志钧，周 璐

目的：观察MicroRNA-34a对人晶状体上皮细胞系SRA01/04衰老和凋亡的影响及作用机制。

方法：qRT-PCR检测年龄相关性白内障(ARC)晶状体和透明晶状体上皮细胞中MicroRNA-34a表达水平，采用脂质体转染试剂盒将MicroRNA-34a mimics(过表达组)、MicroRNA-34a inhibitors(抑制组)和空脂质体(对照组)转染至SRA01/04细胞，qRT-PCR检测MicroRNA-34a的表达量；采用β-半乳糖苷酸(SA-β-gal)染色检测转染后细胞的衰老情况。Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测MicroRNA-34a对人晶状体细胞系SRA01/04细胞凋亡的影响；蛋白免疫印迹检测Cdc42、Rac1蛋白的表达。

结果：透明晶状体前囊膜组织中MicroRNA-34a的表达量显著低于ARC晶状体前囊膜组织(P<0.05)；MicroRNA-34a过表达组、对照组、MicroRNA-34a抑制组SA-β-gal阳性率分别为(87.56±2.34)%、(12.22±2.74)%、(3.45±0.45)%。MicroRNA-34a过表达组明显高于对照组，而MicroRNA-34a抑制组SA-β-gal阳性率明显低于对照组(P<0.05)；MicroRNA-34a抑制组、对照组和MicroRNA-34a过表达组的细胞凋亡率分别为(5.87±1.22)%、(12.26±2.14)%、(29.45±3.12)%，MicroRNA-34a抑制组细胞凋亡率明显低于对照组，而MicroRNA-34a过表达组细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05)；MicroRNA-34a过表达组中Cdc42和Rac1的表达明显高于对照组(P<0.05)，MicroRNA-34a抑制组中Cdc42和Rac1的表达明显低于对照组(P<0.05)。

结论：MicroRNA-34a可能通过上调Cdc42和Rac1促进人晶状体上皮细胞衰老和凋亡。

0 引言

据统计，全球致盲性眼病中，因白内障致盲的患者占比约为50%。随着世界人口增加，老龄化加剧，年龄相关性白内障(age-related cataract，ARC)发病人数逐年上升[1]。目前研究表明，细胞氧化应激是白内障产生的首要因素，病理学研究称为晶状体上皮细胞衰老凋亡[2-3]。微小RNA(MicroRNA)存在于真核生物中，是一类长约18～25个核苷酸的内源性单链非编码RNA，能在转录水平与特定的靶基因3’非翻译区完全或不完全互补配对，促使靶基因在mRNA水平发生降解。现阶段研究表明，MicroRNA作为重要的调节因子，参与多种人类疾病的发展[4]，在疾病的诊断和治疗中发挥积极作用[5]。近年来MicroRNA在眼科疾病的研究已经开展，MicroRNA在哺乳动物眼部表达丰富且分布广泛，高表达于角膜上皮细胞、睫状体、晶状体及视网膜色素上皮细胞。其中ARC中表达最多的是MicroRNA-34a。文献报道称Rho蛋白家族(Cdc42、Rac1等)作为Ras超家族中小分子G蛋白的成员之一，在晶状体上皮细胞和纤维细胞中表达，参与到细胞信号转导[6]，激活其下游靶分子Rho激酶从而参与多种生物效应，譬如维持细胞微观形态功能的稳定、增殖与迁移[7]、基因转录、分化[8-9]、增殖凋亡等[10]。Rac1和Cdc42又是Rho家族蛋白重要成员，有文献指出Rac1和Cdc42能够促进晶状体上皮细胞迁移[11]，但对细胞的衰老和凋亡还没有研究。本文通过观察ARC晶状体和透明晶状体中MicroRNA-34a的表达，探讨其对晶状体细胞衰老和凋亡的研究，以期为白内障的防治提供新的方法。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1组织标本和细胞 透明晶状体前囊膜40例，取自南京医科大学附属儿童医院眼库，来源于眼库角膜移植供体；ARC晶状体前囊膜40例，取自南京医科大学附属儿童医院眼科常规白内障手术术中。透明晶状体前囊膜患者的平均年龄为52.34±5.21岁，ARC晶状体前囊膜患者的平均年龄为52.35±5.19岁。患者及其家属签署知情同意书。晶状体上皮细胞SRA01/04采购自中科院上海细胞生物研究所。本研究经医院伦理委员会批准展开。

1.1.2主要仪器和试剂 胰蛋白酶、qRT-PCR检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；RPIM1640细胞培养基购自美国Gibco公司；Trizol总RNA提取试剂盒购自广东锐博生物科技技术股份有限公司；反转录试剂盒购自美国Sigma；MicroRNA-34a inhibitors、MicroRNA-34a mimics和空脂质体(货号B05009)由上海吉玛制药技术有限公司代为合成；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；青、链霉素购自华北制药有限公司、SYBR Premix Extaq system日本Takara公司；细胞培养箱采购自上海三腾仪器有限公司。兔抗人Cdc42和兔抗人Rac1(WB)购自美国abcam公司、二抗(IHC)、GAPDH鼠抗购自Fermentas公司。实时荧光定量PCR仪购自美国Thermo公司、细胞培养箱购自SANYO、生物安全柜购自haier；高速离心机购自Thermo；Ti-U/Ti-s倒置荧光显微镜购自Nikon。

1.2方法

1.2.1 qRT-PCR检测MicroRNA-34a基因的表达 取透明人晶状体前囊膜组织和ARC人晶状体前囊膜组织，Trizol液与组织处理液混合作用10min，以1.2×104r/min离心10min，去除上层清液，加入Trizol与氯仿震荡混匀，以1.2×104r/min离心20min，加入异丙醇，用移液器吹打均匀，以1.2×104r/min离心10min后，弃去上层清液，留下层絮状沉淀，加入Trizol与乙醇的混合液，以1.2×104r/min离心10min后，弃上清液，提取的RNA用DEPC水溶解，用反转录试剂盒转录cDNA，按照SYBR方法进行实时定量PCR。反应条件为94℃ 30s，1 cycle；95℃ 5s，60℃ 30s，40 cycles；95℃ 5s，60℃ 1min，95℃，1cycle。以U6作为内参，上游引物为5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，下游引物为5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。引物MicroRNA-34a上游引物为5’-CGG CGT GGC AGT GTC TTA G-3’，下游引物为5’-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA CAA CC-3’，结果采用2-△△Ct法计算。

1.2.2细胞培养 液氮中取出人晶状体细胞系SRA01/04，置于37℃水浴溶解，加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养48h，然后离心去上清，加入DMEM培养基悬浮细胞，接种于培养瓶中。置于二氧化碳培养箱中培养，培养条件37℃，5% CO2浓度。传代一次，待细胞处于对数期用于后续研究。

1.2.3细胞转染 调整人晶状体细胞系SRA01/04细胞浓度为1×106个/mL，取2mL接种于6孔板中，培养过夜，采用Lipofectamine2000将浓度均为50nmol/L的MicroRNA-34a mimics、MicroRNA-34a inhibitors和空脂质体转染至细胞。其中转染MicroRNA-34a mimics的细胞作为MicroRNA-34a过表达组，转染MicroRNA-34a inhibitors的细胞作为MicroRNA-34a抑制组，转染空脂质体的细胞作为对照组。qRT-PCR检测MicroRNA-34a的表达量。

1.2.4采用β-半乳糖苷酸(SA-β-gal)染色检测细胞的衰老情况 将各组细胞接种于6孔板培养24h后，离心去除培养基，然后采用PBS洗涤，离心去上清，加入1mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min，PBS洗涤3次，离心，去上清加入1mL染色工作液，37℃孵育过夜，光学显微镜下观察染色结果并进行衰老细胞计数，SA-β-gal阳性细胞(衰老细胞)中可见蓝色沉淀物，分别统计3个不同视野中的细胞总数和SA-β-gal阳性细胞数，SA-β-gal阳性细胞百分比(%)=SA-β-gal阳性细胞个数/总细胞数×100%。

1.2.5 MicroRNA-34a对人晶状体细胞系SRA01/04细胞凋亡的影响 Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡，收集各组细胞，PBS洗涤，离心去除上清，然后加入300μL的结合缓冲液，混匀，加入5μL Annexin V-FITC 和5μL PI，避光孵育30min，然后上机检测，分析细胞早期和晚期凋亡率。

1.2.6蛋白免疫印迹检测Cdc42、Rac1蛋白的表达 收集各组细胞，加细胞裂解液，冰上裂解30min，超声裂解30s，10000r/min，4℃离心10min，收集上清，BCA检测蛋白浓度，待测样品和Loading buffer混合，然后加入至制备好的SDS-PAGE凝胶上样孔中，进行分离，结束后取出凝胶，转膜，封闭，加入兔抗人Cdc42(兔抗人Rac1)，4℃过夜，加入辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG，37℃孵育2h，ECL显影，采用自动凝胶成像系统采集图像，以GAPDH作为内参进行分析。

2 结果

2.1 MicroRNA-34a在透明晶状体前囊膜组织和ARC晶状体前囊膜组织中的表达 qRT-PCR结果显示透明晶状体前囊膜组织中MicroRNA-34a的表达量显著低于ARC晶状体前囊膜组织，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.2 MicroRNA-34a转染晶状体细胞系SRA01/04的表达 qRT-PCR检测结果显示MicroRNA-34a过表达组中MicroRNA-34a的表达明显高于对照组(P<0.05)，MicroRNA-34a抑制组中MicroRNA-34a的表达明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2，提示成功构建MicroRNA-34a过表达/抑制细胞株。

2.3 MicroRNA-34a对人晶状体细胞系SRA01/04细胞衰老的影响 光学显微镜下观察，SA-β-gal阳性细胞中可见蓝色沉淀物。MicroRNA-34a过表达组呈强阳性染色，对照组、MicroRNA-34a抑制组着染阴性。MicroRNA-34a过表达组、对照组、MicroRNA-34a抑制组SA-β-gal阳性率分别为(87.56±2.34)%、(12.22±2.74)%、(3.45±0.45)%。MicroRNA-34a过表达组明显高于对照组，而MicroRNA-34a抑制组SA-β-gal阳性率明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示过表达MicroRNA-34a可促进SRA01/04细胞衰老，见图3。

2.4 MicroRNA-34a对人晶状体细胞系SRA01/04细胞凋亡的影响 MicroRNA-34a抑制组、对照组和MicroRNA-34a过表达组的细胞凋亡率分别为(5.87±1.22)%、(12.26±2.14)%和(29.45±3.12)%，MicroRNA-34a抑制组细胞凋亡率明显低于对照组，而MicroRNA-34a过表达组细胞凋亡率明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4。

2.5 MicroRNA-34a对Cdc42和Rac1蛋白的影响 Western blot检测结果显示，MicroRNA-34a过表达组中Cdc42和Rac1的表达明显高于对照组，MicroRNA-34a抑制组中Cdc42和Rac1的表达明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图5。

3 讨论

随着当今社会老龄化发展，有报告指出2020年我国50岁以上患白内障的人群将达到总人数的1/4，白内障手术需求量逐年增加，给国家和个人带来了巨大的经济负担。因此研究ARC的发病机制，寻找非手术的治疗方法，具有重大意义。

图1 MicroRNA-34a在透明晶状体前囊膜组织和ARC晶状体前囊膜组织的表达aP<0.05vs透明晶状体前囊膜组织。

图2 RT-PCR检测MicroRNA-34a在人晶状体细胞系SRA01/04中的表达aP<0.05vs对照组。

文献报道[12]称ARC是晶状体衰老的表现，而氧化损伤是ARC发生的独立危险因素。随着年龄增加，细胞机能减退，细胞代谢产物和外部因子均不断形成自由基，衰老的晶状体细胞酶活性下降，抗氧化能力减弱，多余的自由基无法被清除，出现积累，就会对晶状体产生氧化损伤，进而攻击细胞膜，导致脂质过氧化，造成蛋白质和DNA损伤，导致晶状体混浊[12-13]。表观遗传学调控基因表达的机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰及微小RNA(MicroRNA)。其中MicroRNA的出现，为研究开拓了新思路。MicroRNA在哺乳动物中保持高度同源性，可与靶基因序列3’非编码区结合，通过调节基因的转录表达，调节细胞的生长发育、分化、增殖、凋亡和衰老等。文献报道称在过氧化氢诱导的早衰细胞以及自然复制性衰老细胞中MicroRNA-34a表达均会出现异常升高[14-15]。

文献报道称患者晶状体混浊程度与MicroRNA-34a表达呈明显的正相关关系，提示MicroRNA-34a在ARC发生发展过程中起着关键作用[16]。本研究qRT-PCR结果显示透明晶状体前囊膜组织中MicroRNA-34a的表达量显著低于ARC晶状体前囊膜组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。为了进一步观察MicroRNA-34a在ARC中的作用，本研究又以SRA01/04细胞株为研究对象，采用细胞转染技术构建MicroRNA-34a过表达抑制细胞株，然后观察MicroRNA-34a对SRA01/04细胞的衰老和凋亡的影响。文献报道[17]称衰老的细胞中β-半乳糖苷酶的表达量会极具升高，因此SA-β-gal染色阳性常常作为细胞衰老的生物学标志。本研究通过SA-β-gal染色检测MicroRNA-34a对SRA01/04细胞衰老情况的影响，结果显示MicroRNA-34a过表达组呈强阳性染色，空脂质体组、MicroRNA-34a抑制组着染阴性，阳性率分别为(87.56±2.34)%、(12.22±2.74)%、(3.45±0.45)%，MicroRNA-34a过表达组明显高于对照组和MicroRNA-34a抑制组，差异均有统计学意义(P<0.05)。进一步采用流式细胞术检测MicroRNA-34a对SRA01/04细胞凋亡的影响，结果显示MicroRNA-34a抑制组、对照组和MicroRNA-34a过表达组的细胞凋亡率分别为(5.87±1.22)%、(12.26±2.14)%和(29.45±3.12)%，MicroRNA-34a抑制组细胞凋亡率明显低于对照组，而MicroRNA-34a过表达组细胞凋亡率明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示过表达MicroRNA-34a可促进SRA01/04细胞衰老和凋亡。

图3 MicroRNA-34a对人晶状体细胞系SRA01/04细胞衰老的影响(×200) A：MicroRNA-34a抑制组；B：对照组；C：MicroRNA-34a过表达组;D：三组SA-β-gal阳性率比较，aP<0.05vs对照组。

图4 MicroRNA-34a对人晶状体细胞系SRA01/04细胞凋亡的影响 A：MicroRNA-34a抑制组；B：对照组；C：MicroRNA-34a过表达组;D：三组细胞凋亡率比较，aP<0.05vs对照组。

图5 MicroRNA-34a对Cdc42和Rac1蛋白的影响 A：三组Western blot检测结果；B：三组Cdc42的表达比较；C：三组Rac1的表达比较。aP<0.05vs对照组。

Rho蛋白家族能够参与并调节细胞增殖、基因表达及细胞骨架重组，是参与细胞内信号转导的重要蛋白，能够改变和影响细胞生物学功能。其中Cdc42蛋白作为Rho家族蛋白重要成员之一，主要参与调解细胞骨架中肌动蛋白重排、调控蛋白激酶，启动细胞内外信号等来影响细胞增殖、侵袭、分化和转移等[18]。Rac1蛋白作为信号传导通路关键因子，文献报道称[19]其是信号传导通路中的分子开关。本研究发现，MicroRNA-34a过表达可促进晶状体上皮细胞凋亡。本研究Western blot检测结果显示MicroRNA-34a过表达组中Cdc42和Rac1的表达明显高于对照组，MicroRNA-34a抑制组中Cdc42和Rac1的表达明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示MicroRNA-34a能通过调节Cdc42、Rac1基因表达来促进人晶状体上皮细胞SRA01/04的衰老和凋亡。

综上所述，MicroRNA-34a在ARC人晶状体上皮细胞中高表达，其可能通过调节Cdc42、Rac1基因表达，调控人晶状体上皮细胞衰老和凋亡这一生理过程，从而在白内障的发病机制中行使重要的功能，成为白内障诊治的潜在新途径。