miR-21调节NF-κB信号通路对瘢痕成纤维细胞增殖及凋亡的影响

周晟

（绍兴第二医院，浙江 绍兴 312000）

成纤维细胞对于创伤愈合具有关键性的作用，对于结缔组织的完整性有一定的维持作用，能够生成和重塑细胞外基质（ECM）[1-2]。miRNA作为单链小RNA能通过碱基配对同靶基因互补，调控基因表达，在机体或细胞的生理病理上具有重要的参与作用[3-4]。miR-21作为其中的一种，与纤维化病变中的信号通路相关[5]，现探讨其对瘢痕成纤维细胞增殖和凋亡的机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 选择2019年4-12月本院收治的增生性瘢痕患者，取其正常皮肤成纤维细胞GM0639和增生性瘢痕成纤维细胞（hypertrophic scar fibroblasts，HSF）；其余材料为：Lipofectamine2000 试剂盒（上海蔚霆生物，批号：SU2020）、胎牛血清（依莱萨生物，批号：12676-029）、DMEM 培养液（上海杰美基因医药，批号：GMS12052.3）、磷酸盐缓冲液（上海泽叶生物，批号：2505027）、0.25%胰蛋白酶（广州市达辉生物，批号：25200056）、BCA蛋白定量检测试剂盒（上海康朗生物，批号：KL80816-500）、二甲基亚砜（苏州联雄精细化工科技，批号：67-68-5）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 在DMEM培养液（含10%胎牛血清）恒温培养箱（37℃、5% CO2）中培养 HSF，两天更换一次培养液，3-5天时用胰蛋白酶（0.25%）消化传代，当其培养至3-5代且处于对数生长期时收集细胞进行后续实验。

1.2.2 细胞转染与分组 将培养的HSF细胞分为空白对照组 （无转染）、miR-21 mimic组 （转染miR-21质粒的HSF细胞）、miR-21 inhibitor组（转染miR-21抑制剂的HSF细胞）以及阴性对照组（转染非特异性siRNA），培养至70%～80%融合度时接种细胞瓶中按照Li-pofectamineTM2000试剂说明书对其转染，2天后倒掉细胞培养液并以PBS清洗细胞，使用20μL细胞裂解液裂解细胞。

1.2.3 miR-21表达 采用RT-PCR检测miR-21的表达。通过Trizol法对细胞总RNA进行提取，纯化定量后按照逆转录试剂盒步骤合成cDNA，再以RT-PCR试剂盒的步骤测定miR-21表达，以U6为内参，通过2-△△Ct公式分析表达情况。

1.2.4 NF-κB信号通路相关蛋白的表达 采用蛋白质印迹（WB）检测NF-κB信号通路相关蛋白的表达。将上述裂解细胞离心（-4℃，20分钟，1500g），收集上清液，通过SDS-PAGE电泳蛋白分离，而后转PVDF膜，加入一抗（1:500）室温下孵育一夜、TBS洗涤后加入二抗（1:3000）孵育1小时，加入显色剂，将β-actin作为内参，最终通过凝胶成像系统检测并分析相关蛋白。

1.2.5 细胞增殖检测 采用MTT法检测细胞增殖情况。接种细胞至24孔板，每孔2×104个细胞，培养72 小时，再将各孔加入 MTT 溶液（pH 7.4， 20μL），37℃下孵育4小时，弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO，150μL），振荡 10 分钟反应，蓝紫色结晶溶解后对A570进行检测，即细胞的增殖活性，重复3次。

1.2.6 细胞凋亡检测 将上述裂解细胞以1500g的条件离心10分钟，收集细胞，以PBS（2mL）重悬并洗涤细胞3次，沉淀悬浮细胞（Binding Buffer 400μL）后，加入 Annexin V-FITC（5μL）、PI（5μL）溶液，置于室温下反应15分钟后，以流式细胞仪测定细胞凋亡情况。

1.3 统计学处理 采用SPSS 24.0软件处理数据。计量资料以（±s）表示，多组间采用F检验；计数资料以百分率表示，采用χ2检验。

2 结果

2.1 miR-21的表达 RT-PCR检测发现，miR-21的表达在HSF细胞中 （1.49±0.11）较正常成纤维细胞（1.01±0.04）高，差异有统计学意义（P＜0.01），详见图 1。

图1 正常成纤维细胞与HSF细胞中miR-21的表达情况

2.2 NF-κB信号通路相关蛋白的表达 阴性对照组中 NF-κBp65、IKK、Bax、Caspase-3 的表达与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），miR-21 inhibitor 组中 NF-κB p65、IKK 的表达降低，Bax、Caspase-3的表达上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；miR-21 mimic组中 NF-κB p65、IKK 的表达较高，Bax、Caspase-3的表达较低，差异有统计学意义（P＜0.05）。 详见表 1、图 2。

表1 各组NF-κB信号通路相关蛋白的表达（±s）

表1 各组NF-κB信号通路相关蛋白的表达（±s）

与空白对照组比较*P＜0.05

组别 n NF-κB p65 IKK Bax Caspase-3空白对照组 24 5.37±1.01 6.45±1.06 5.58±0.07 4.40±1.00阴性对照组 24 5.41±0.09 6.37±1.07 5.73±0.08 4.38±0.08 miR-21 inhibitor组24 2.23±0.05*3.33±0.04*7.88±1.69*6.69±1.22*miR-21 mimic 组 24 10.44±2.51*11.67±2.72*3.34±0.06*2.12±0.02*

图2 WB检测各组NF-κB信号通路相关蛋白的表达

2.3 细胞增殖情况 阴性对照组与空白对照组增殖情况差异无统计学意义（P＞0.05），而miR-21 mimic组则有所上升，miR-21 inhibitor组的增殖能力有所下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。详见表 2、图 3。

表2 各组不同时间细胞的增殖情况（±s）

表2 各组不同时间细胞的增殖情况（±s）

与空白对照组比较*P＜0.05.

组别 n A 5 7 0值2 4小时 3 6小时 4 8小时 7 2小时空白对照组 2 4 0.1 9±0.0 2 0.2 4±0.0 4 0.3 5±0.0 2 0.4 1±0.0 4阴性对照组 2 4 0.2 0±0.0 1 0.2 4±0.0 3 0.3 5±0.0 1 0.4 1±0.0 3 m i R-2 1 i n h i b i t o r组 2 4 0.1 9±0.0 1*0.2 1±0.0 1*0.3 0±0.0 1*0.3 6±0.0 2*m i R-2 1 m i m i c 组 2 4 0.2 0±0.0 2*0.2 6±0.0 6*0.3 9±0.0 4*0.5 5±0.0 5*

图3 各组细胞的增殖情况

2.4 细胞凋亡情况 阴性对照组的凋亡能力与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），miR-21mimic组的凋亡能力较低，miR-21 inhibitor组的凋亡能力较高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 详见图 4、表 3。

表3 各组细胞凋亡率比较（±s）

表3 各组细胞凋亡率比较（±s）

与空白对照组比较*P＜0.05.

组别 n 细胞凋亡率（%）空白对照组 24 15.87±6.33阴性对照组 24 15.86±6.34 miR-21 inhibitor组 24 60.11±8.30*miR-21 mimic 组 24 3.22±1.67*

图4 各组细胞凋亡情况

2.5 相关性分析 miR-21与NF-κB p65、IKK呈正相关（r=0.691、r=0.604，P＜0.05），与 Bax、Caspase-3 呈负相关（r=-0.597、r=-0.625，P＜0.05）。 详见表 4。

表4 miR-21与NF-κB信号通路中相关蛋白的相关性分析

3 讨论

作为机体对创伤产生非正常愈合反应的一种结果，瘢痕具有ECM过度沉积、成纤维细胞大量增殖且排列紊乱等病理特征[6]，与免疫异常、胶原的合成降解紊乱等可能有关[11]。由于其形成的机制复杂且影响因素广泛，无法针对性治疗[7]，又由于成纤维细胞在瘢痕的形成过程中具有重要的参与作用[8]，因而对其增殖及凋亡的探讨非常重要。

miRNAs是长度约23nt的一种非编码小RNA，具有高度的保守性[9]，可在与靶基因的完全结合或不完全结合的情况下对其翻译加以降解或阻挠，从而调控细胞或机体的生物学功能，参与肿瘤的一系列病理过程[11]。miR-21在非小细胞肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌等多种癌症中均有异常表达且参与作用[11-12]。NF-κB信号通路对于正常细胞的增殖凋亡、机体免疫等活动有一定的参与作用[13]，是一种核转录因子，由p50和p65组成，对细胞内的信号转导具有重要的介导作用，能够特异性结合细胞粘附分子及其生长分化所需的细胞因子，从而对有关基因的转录及表达产生作用[14]。

本研究对miR-21在调控NF-κB信号通路的基础上影响瘢痕成纤维细胞生命活动的相关机制进行研究，作者选择正常人皮肤成纤维细胞GM0639以及HSF细胞，培养HSF细胞后分为空白对照组、阴性对照组、miR-21 mimic组以及miR-21 inhibitor组。并对其进行转染，转染后RT-PCR检测结果显示，HSF中miR-21的表达较正常成纤维细胞较高（P＜0.05），提示瘢痕症状后 miR-21 表达上升，通过WB 检测发现，阴性对照组中 NF-κB p65、IKK、Bax、Caspase-3的表达与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），miR-21 inhibitor组中 NF-κB p65、IKK的表达较对照组降低，Bax、Caspase-3的表达有所上升（P＜0.05）；miR-21 mimic 组中 NF-κB p65、IKK 的表达较高，Bax、Caspase-3 的表达较低（P＜0.05）， 提示 miR-21 可能会提高NF-κB p65、IKK 的表达，降低Bax、Caspase-3的表达。通过MTT检测，转染miR-21后成纤维细胞增殖能力上升，转染miR-21抑制剂后增殖能力下降。流式细胞术检测提示，阴性对照组的凋亡能力与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），miR-21 mimic 组凋亡能力较低，miR-21 inhibitor组凋亡能力较高，提示miR-21会抑制瘢痕成纤维细胞的凋亡能力。最后，通过相关性分析发现，miR-21与 NF-κB p65、IKK 呈正相关，与 Bax、Caspase-3 呈负相关（均 P＜0.05），提示miR-21对NF-κB信号通路可能具有一定的影响。

综上，miR-21能够促进瘢痕成纤维细胞的增殖能力，降低瘢痕成纤维细胞的凋亡能力，可能是通过升高NF-κB信号通路中NF-κB p65、IKK的表达、降低NF-κB信号通路中Bax、Caspase-3的表达完成。