连钱草活性成分的浊点萃取工艺优化

周子轩 谢建开 季泽涛 申奥 黄菊

摘   要：为优化浊点萃取法提取连钱草中活性成分的工艺条件，以提取液对DPPH自由基清除率为指标，采用单因素实验预先确定各因素的适宜水平，再进一步利用正交实验确定最优工艺条件。实验结果表明，当料液比为1∶35，平衡时间为60 min，离子浓度为0.7 mol/L，表面活性剂质量浓度为50 g/L时，连钱草活性成分的提取率最大，对DPPH自由基清除率为88.22%。

关键词：浊点萃取;活性成分;连钱草;正交实验

连钱草属于唇形科活血丹属，分布区域广泛，在全国各地都很常见。作为中医主要药材，通常用于民间医学治疗高尿酸血症、风湿病、痛风、肾炎、肾结石、尿道炎和膀胱炎。从连钱草中提取得到的化学成分主要是黄酮及其苷类、萜类化合物[1]。目前，常用的天然植物提取方法包括水提法、有机溶剂提取以及超临界萃取等，但各自都存在一定的缺点，如耗时长、污染环境等，尤其是当今社会对低污染的需求越来越大、重视程度越来越高，因此，选择一种简单、高效、环境友好的提取方法对连钱草的进一步开发应用具有重要的现实意义[2-3]。

浊点萃取法是近年来出现的一种新兴的液-液萃取技术，以中性表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础，改变实验参数引发相分离，将疏水性物质与亲水性物质分离[4-5]。具有操作简单、提取率高、活性成分在提取过程中不易变性、不使用挥发性有机溶剂和环境友好等特点，本实验选用TritionX-110为表面活性剂进行浊点萃取，通过正交实验法优化提取工艺参数，考察表面活性剂质量浓度、料液比、离子强度、温度和平衡时间等对提取效果的影响，从而获得连钱草活性成分提取的最佳工艺条件。

1    实验部分

1.1  实验仪器和试剂

1.1.1  仪器

离心机H1850，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;紫外可见分光光度计T6，北京普析通用仪器有限责任公司;超声波清洗机JP-040S，深圳市洁盟清洗设备有限公司;电子天平JA2003，上海方瑞仪器有限公司;鼓风干燥箱DHG-9070A，苏州江东精密仪器有限公司。

1.1.2  试剂

聚乙二醇锌基苯基醚（TritionX-110），阿拉丁试剂公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），美国Sigma公司;无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、氯化钠和水杨酸等均为国产分析纯。

1.2  实验方法

1.2.1 连钱草活性成分提取

连钱草烘干粉碎后过60目筛，称取1 g粉末样品，加入TritionX-110水溶液按一定料液比混合均匀，超声30 min后放入高速离心机（8 000 r/s）中离心30 min，上层液体转移至锥形瓶，加入适量氯化钠，置于45 ℃水浴锅中，出现分层，提取油性部分，加入15 mL无水乙醇，充分震荡后放入离心机中离心5 min（6 000 r/s），上层液体倒入容量瓶中定容，待测。

1.2.2  DPPH自由基清除率测定

将连钱草活性成分提取液稀释成最佳样品质量浓度，用移液枪准确获得待测样品液2 mL，吸取浓度为0.1 mmol/L的DPPH溶液6 mL，转到试管中，充分震荡，在暗室低温情况下静放50 min，无水乙醇作参比液，通过紫外-可见分光光度计在517 nm波长处测定其吸光度值为A1;把2 mL的无水乙醇加入到6 mL浓度为0.1 mmol/L的DPPH溶液中，并测得其吸光度值为A0，把2 mL的无水乙醇加入到6 mL的待测样品液中，测得其吸光度值为A2。DPPH自由基清除率（S）计算公式为：

S=

1.2.3  单因素实验

选取对连钱草活性成分提取率影响较大的4个因素：料液比（表面活性剂溶液体积与连钱草粉末质量之比，mL/g）、离子强度（氯化钠的浓度，mol/L）、平衡时间（min）、表面活性剂质量浓度（g/L），进行单因素实验从而确定各因素的适宜水平。

1.2.4  正交实验

根据单因素实验结果，每个因素选取3个水平进行正交实验，如表1所示。

2    结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1  平衡时间对DPPH清除率的影响

如图1所示，当平衡时间增加时，连钱草活性成分提取液的DPPH清除率急剧上升，从40 min开始出现不同程度的下降。因此，选定最优平衡时间为40 min。

2.1.2  料液比对清除率的影响

由图2可知，当料液比从1∶15到1∶55时，提取液的DPPH清除率先上升而后下降，在1∶35时达到峰值。这是因为随着液料比增大，提取溶剂越多，活性成分提取率就越大，这就使DPPH清除率提高，所以，浊点萃取的最优料液比为1∶35。

2.1.3  离子浓度对清除率的影响

由图3可知，当溶液的离子浓度从0.5 mol/L提高到0.6 mol/L时，连钱草活性成分提取液的DPPH清除率上升得非常快，而当离子浓度超过0.6 mol/L时，清除率便开始缓慢下降。这是由于TritionX-110的聚集数随着离子强度的增加而增加，TritionX-110对连钱草活性成分的增溶能力得到提高。同时，加入NaCl能改变非离子表面活性剂的浊点温度。但是，如果NaCl溶液的浓度不断地提高，溶液浓缩系数会不断上升，当达到一定值时，会导致萃取效率变化不明显，此时，NaCl浓度的影响就不大，同时，考慮到成本的节约以及回收资源的问题，最终选定NaCl浓度为0.6 mol/L。

2.1.4  表面活性剂质量浓度对活性成分提取效率的影响

由圖4可知，当表面活性剂质量浓度从20 g/L增加到40 g/L时，提取液的清除率都可达到一个较高的值。当表面活性剂质量浓度从40 g/L升到50 g/L时，对DPPH清除率下降。而当质量浓度超过50 g/L时，又出现上升趋势，产生这种现象的原因可能是当表面活性剂质量浓度达到一定值时，随着其质量浓度的增长出现增溶等问题。因此，TritionX-110的最佳质量浓度为30 g/L。

2.2  正交实验结果

连钱草活性成分提取液的DPPH清除率正交实验结果如表2所示。

对正交实验结果进行极差分析可知，料液比对连钱草活性成分提取物DPPH清除率的影响最大，平衡时间对清除率的影响紧随其后，影响最小的是离子浓度。因此可得，影响连钱草活性成分提取物DPPH清除率的先后顺序为B>A>D>C，即料液比>平衡时间>表面活性剂的质量浓度>离子浓度。分析k值可知，浊点萃取连钱草活性成分的最优工艺条件为A3B2C2D3，即平衡时间60 min，料液比1∶35，离子浓度0.7 mol/L，表面活性剂（TritionX-110）的质量浓度50 g/L。

按照最优实验条件，进行3组平行实验，将提取液稀释至40 g/L，通过使用紫外-可见分光光度计测量各组的DPPH清除率，分别为84.30%、88.73%和87.64%，其平均值为86.89%，相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）为2.66%。可以确定此浊点萃取工艺可行。

3    结语

利用浊点萃取工艺提取连钱草中的活性成分，以对DPPH自由基清除率为考察指标，通过单因素和正交实验优化了连钱草活性成分提取的最优条件。

（1）各个因素对提取效率的影响强弱顺序是：料液比>平衡时间>表面活性剂质量浓度>离子浓度。连钱草活性成分的最优提取工艺是：料液比1∶35，平衡时间60 min，表面活性剂质量浓度50 g/L，离子浓度0.7 mol/L。验证性实验得出其清除率平均值为86.89%，相对标准偏差RSD为2.66%，在标准偏差之内。

（2）浊点萃取法用于连钱草活性成分的提取是一种行之有效的方法，黄酮类活性成分可以被表面活性剂有效萃取，实验以纯水为提取剂，不使用有机溶剂等挥发性物质，成本低、无污染，后续实验可进一步表征提取物的化学成分和结构。

[参考文献]

[1]刘晓鹏，张俊霞，姜   宁，等.响应面试验优化超声辅助提取连钱草多糖工艺及其体外抗氧化活性[J].食品科学，2016，37（4）：13-19.

[2]姜   宁，刘晓鹏，丁峰峻，等.微波辅助提取连钱草总黄酮的研究[J].河南农业科学，2015，44（4）：169-172.

[3]刘   学，曹莹粲，韩王康，等.浊点萃取法提取黑种草子粕抗氧化剂的工艺研究[J].日用化学工业，2014，44（11）：624-627.

[4]MADEJ K，PERSONA K.Drug screening in human plasma by cloud-point extraction and HPLC[J].Central European Journal of Chemistry，2013，11（1）：94-100.

[5]STEFANOVA T S，SIMITCHIEV K K，GAVAZOV K B.Liquid-liquid extraction and cloud point extraction for spectrophotometric determination of vanadium using 4-（2-pyridylazo）resorcinol[J].Chemical Papers，2015，69（4）：495-503.