沙棘籽粕多酚提取工艺优化、组分分析及抗氧化性能研究

孔 宇，张倚菲，韩鹏云，韦柳伊，李文华，王禹鹤，赵紫芙，李欣忆，李 超

(天津科技大学 食品工程与生物技术学院，天津 300457)

沙棘原产于欧亚大陆，是一种耐寒的胡颓子科沙棘属灌木植物,广泛生长于印度、中国、巴基斯坦、俄罗斯、英国、德国和法国等国家。沙棘浆果中含有丰富的维生素C、类黄酮、油溶性化合物以及矿物质等营养物质[1]。这些营养性物质使沙棘浆果具有特殊的生物活性，可用于治疗心血管疾病、癌症和急性高山病等多种疾病。沙棘籽油含有大量不饱和脂肪酸、生育酚、类胡萝卜素和黄酮类化合物，具有显著的抗菌、抗动脉粥样硬化和心脏保护作用[2-3]。

我国每年沙棘的种植面积为120万hm2[4]，可收获115.2万t沙棘鲜果[5]。每吨沙棘鲜果可产生30 kg沙棘湿籽，提取油脂后会产生13.8 kg沙棘籽粕，因此沙棘籽粕的年产量达到1.5万t[5-6]。沙棘籽粕中含有20%的纤维素、10%的半纤维素和约30%的蛋白质[7]。虽然沙棘籽粕中蛋白质含量丰富，但由于多酚的存在，蛋白质的利用率比较低。崔淼[8]对沙棘籽粕中的蛋白进行了提取及功能性研究，得到的蛋白为褐色粉末，严重影响了蛋白质的加工利用。这是由于酚类化合物在碱性条件下被氧化成醌，醌能缩合形成高相对分子质量的褐色素，这些褐色产物保持高活性并易与蛋白质中的巯基和氨基结合，降低蛋白质的消化率和利用率[9]。植物多酚是植物细胞内的重要植物色素、抗氧化剂及具有多种功能的保护因子，具有抑菌、抗肿瘤等作用[10]。本实验以沙棘籽粕为原料，通过单因素实验分析结合正交实验优化沙棘籽粕多酚提取工艺，研究沙棘籽粕多酚组分及抗氧化能力，旨在为沙棘籽粕多酚利用提供理论依据，并为沙棘籽粕蛋白提取前处理提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

沙棘籽粕，内蒙古宇航人高技术产业有限责任公司；牛血清白蛋白、福林酚，北京索莱宝科技有限公司；考马斯亮蓝G-250，上海迈瑞尔化学技术有限公司；没食子酸、原儿茶素、新绿原酸、儿茶素、绿原酸、表儿茶素、阿魏酸、芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚标准品，上海源叶生物科技有限公司；其余化学试剂均为国产分析纯。

Agilent-1260高效液相色谱仪，美国安捷伦仪器公司；JP-031超声波清洗机；DF-101型系列集热式恒温加热磁力搅拌器；德国IKA RV8旋转蒸发仪；电子天平；UV-1800紫外可见分光光度计；XY-FD-27S加热型冷冻干燥机；3-18台式高速冷冻离心机，德国Sigma；1510-01116全波长酶标仪，芬兰Thermo Fisher。

1.2 实验方法

1.2.1 沙棘籽粕多酚的提取

沙棘籽粕经粉碎后过80目筛，用10倍的石油醚浸泡脱脂2 h。取脱脂沙棘籽粕，按一定料液比加入提取溶剂，按一定方式(冷摇，超声或恒温静置)在一定温度下提取一定时间，离心取上清液，残渣重复提取2次，合并上清液，得到多酚提取液。

1.2.2 多酚含量测定及得率计算

参考Okarter等[11]的方法，采用福林-酚法测定多酚提取液中的多酚含量，按下式计算多酚得率。

多酚得率=多酚提取液体积×多酚含量/沙棘籽粕质量×100%

1.2.3 蛋白质含量测定及得率计算

采用考马斯亮蓝法[12]，以牛血清白蛋白含量为横坐标，溶液的吸光度为纵坐标，得到标准曲线回归方程为y=0.764 7x+0.040 1(R2=0.996 9)。根据标准曲线回归方程测得多酚提取液中蛋白质含量，按下式计算蛋白得率。

蛋白得率=多酚提取液体积×蛋白质含量/沙棘籽粕质量×100%

1.2.4 沙棘籽粕多酚提取液组分分析

将沙棘籽粕多酚提取液浓缩到一定体积后加入甲醇定容，吸取4 mL样品进行超滤(超滤膜截留相对分子质量100 kDa)，透过超滤膜的部分为游离态酚，过0.45 μm滤膜，采用HPLC测定有效成分的含量[8]。

HPLC条件：Shim-pack GIST C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；紫外检测波长280 nm；流速0.8 mL/min；柱温30℃；流动相以含2%冰醋酸的水溶液和甲醇分别为A相和B相，梯度洗脱。梯度洗脱条件：0～20 min，0～5%B；20～35 min，25%～45%B；35～40 min，40%～40%B；40～41 min，40%～90%B；41～50 min，95%～95%B；50～52 min，95%～5%B；52～55 min，5%～5%B。以标准品的保留时间对样品的色谱峰定性，采用外标法进行定量。

1.2.5 沙棘籽粕多酚抗氧化性测定

沙棘籽粕多酚提取液经30℃真空浓缩、冷冻干燥，得到多酚提取物，于-18℃贮藏，用于抗氧化性分析。

参考Zhang等[13]的方法，将样品配制为多酚质量浓度分别为0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/mL的溶液，分别取样液5 mL，加入2 mmol/L的DPPH乙醇溶液5 mL，混合均匀，置于室温下避光反应30 min。以蒸馏水代替样品，作为空白组。以无水乙醇5 mL代替2 mmol/L的DPPH乙醇溶液作为对照组。每组进行3次平行实验。取1 mL反应好的溶液，在4℃、6 000 r/min的冷冻离心机中离心10 min，在96孔板中加入每个样品的上清液0.2 mL，并在517 nm处测定吸光度，按下式计算DPPH自由基清除率。

1.2.5.2 羟自由基清除能力测定

参考李顺峰等[14]的方法，将样品配制为多酚质量浓度分别为0.01、0.05、0.10、0.25、0.50 mg/mL溶液。依次取5 mmol/L的硫酸亚铁溶液2 mL、5 mmol/L的水杨酸乙醇溶液2 mL、3 mmol/L的过氧化氢溶液2 mL，均匀混合后加入2 mL样品溶液，最后用蒸馏水补至10 mL，在37℃下水浴30 min。以蒸馏水代替样品，作为空白组。以蒸馏水2 mL代替3 mmol/L过氧化氢溶液作为对照组。每组进行3次平行实验。取1 mL反应好的溶液，在4℃、6 000 r/min的冷冻离心机中离心10 min，在96孔板中加入每个样品的上清液0.2 mL，在510 nm处测定吸光度，按下式计算羟自由基清除率。

2 结果与分析

2.1 沙棘籽粕多酚提取的单因素实验

2.1.1 提取溶剂对多酚和蛋白得率的影响

多酚因含酚羟基的化学结构，可与大分子、蛋白质或多糖相互结合，形成非共价作用结构[15]。不同性质的有机溶剂提取，由于溶剂极性不同，可断裂非共价作用力不同，所以破坏多酚在植物体内形成的氢键或疏水键不同，因此多酚提取效果不同[16]。甲醇、乙醇、异丙醇溶液既可保持较高的多酚得率，又对蛋白质的溶解度低[17]，有利于后续蛋白质开发利用。使用60%乙醇、80%甲醇、70%异丙醇作为提取溶剂，在料液比1∶15、超声频率40 kHz、超声功率150 W、提取温度30℃、提取时间30 min条件下，考察提取溶剂对多酚和蛋白得率的影响，结果见图1。

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图1 提取溶剂对多酚和蛋白得率的影响

由图1可见：80%甲醇溶液作为提取溶剂，沙棘籽粕多酚得率最高；3种有机溶剂的蛋白得率均很低，说明仅有少量的蛋白质溶出。因此，沙棘籽粕多酚的最佳提取溶剂为80%甲醇溶液。

2.1.2 提取方式对多酚和蛋白得率的影响

在提取溶剂为80%甲醇溶液、料液比1∶15、重复提取2次的条件下，考察提取方式对多酚和蛋白得率的影响，结果见图2。

注：冷摇提取方式为4℃、150 r/min下提取30 min；超声提取方式的提取条件为超声频率40 kHz、超声功率150 W、提取时间30 min、提取温度30℃；恒温静置提取方式为在30℃水浴中静置提取30 min。

图2 提取方式对多酚和蛋白得率的影响

由图2可见，超声提取对沙棘籽粕多酚的提取效果最好，其次为恒温静置提取，最后为冷摇提取。这是由于超声的空化作用使样品与溶剂接触更充分，提高了多酚得率[18]。冷摇提取温度较低，不利于多酚类成分溶出。3种提取方式对蛋白得率的影响不大，蛋白得率均很低。因此，选择超声提取作为沙棘籽粕多酚提取的最佳提取方式。

2.1.3 料液比对多酚得率的影响

在80%甲醇溶液为提取溶剂、超声频率40 kHz、超声功率150 W、提取时间30 min、提取温度30℃条件下，考察料液比对多酚得率的影响，结果见图3。

由图3可见，沙棘籽粕多酚得率随料液比的增加先上升后逐渐趋于平缓，当料液比为1∶20时，多酚得率最高，主要是因为增大溶剂用量有利于多酚物质由原料向溶剂扩散，增加多酚得率，但溶剂用量过大，半纤维素等其他成分的溶出量增多，影响多酚物质的提取[19]。提取溶剂用量过大，回收溶剂处理的时间更长，还会造成一定的资源浪费，增加提取成本，因此最佳料液比为1∶20。

注：图中不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

2.1.4 提取时间对多酚得率的影响

在80%甲醇为提取溶剂、超声频率40 kHz、超声功率150 W、料液比1∶20、提取温度30℃条件下，考察提取时间对多酚得率的影响，结果见图4。

图4 提取时间对多酚得率的影响

由图4可见，随着提取时间的延长，多酚得率呈先上升后下降趋势。这主要是由于随着提取时间的延长，多酚溶出量逐渐增多，多酚得率升高，但超声提取时间过长，溶液温度升高，多酚的稳定性变差，发生氧化反应或分解反应，造成多酚得率降低[20]。因此，最佳提取时间为20 min。

2.1.5 提取温度对多酚得率的影响

在80%甲醇为提取溶剂、超声频率40 kHz、超声功率150 W、料液比1∶20、提取时间20 min条件下，考察提取温度对多酚得率的影响，结果见图5。

图5 提取温度对多酚得率的影响

由图5可见，随提取温度的升高，多酚得率呈先增加后降低的趋势。这主要是因为随着提取温度的升高，多酚溶出量增多，多酚得率增加，但提取温度过高，多酚稳定性降低，发生氧化或分解反应，造成得率降低。因此，最佳提取温度为20℃。

2.2 沙棘籽粕多酚提取的正交实验

通过单因素实验确定80%甲醇为提取溶剂，采用超声提取方式，在超声频率40 kHz、超声功率150 W条件下，以料液比、提取温度和提取时间为因素，多酚得率为指标，进行三因素三水平正交实验，对多酚提取条件进行优化。正交实验因素与水平见表1，正交实验设计及结果见表2，方差分析见表3。

表1 正交实验因素与水平

表2 正交实验设计及结果

表3 方差分析

由表2可知，影响多酚得率的因素主次顺序为料液比>提取时间>提取温度，最佳提取工艺条件组合为A3B2C2。由表3可知，料液比对多酚得率具有显著性影响，提取温度和提取时间影响不显著。多酚的最佳提取工艺条件为：料液比1∶25，提取温度20℃，提取时间20 min。在最佳条件下做验证实验，多酚得率为(7.83±0.03)%。

2.3 沙棘籽粕多酚的HPLC分析

将质量浓度为1 mg/mL没食子酸、原儿茶素、表儿茶素、绿原酸、新绿原酸、阿魏酸和质量浓度为0.4 mg/mL的芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚、儿茶素的混合多酚标准品溶液以及最佳条件下提取的沙棘籽粕多酚提取液进行HPLC分析，结果如图6所示。

注：1.没食子酸；2.原儿茶素；3.新绿原酸；4.儿茶素；5.绿原酸；6.表儿茶素；7.阿魏酸；8.芦丁；9.杨梅素；10.槲皮素；11.山奈酚；12.溶剂峰。

图6 多酚标准品(A)及沙棘籽粕多酚提取液(B)的HPLC谱图

由图6可见，沙棘籽粕多酚提取液中共有6种物质保留时间与标准品溶液的色谱峰保留时间一致，经外标法定量，这6种酚类物质的含量(以沙棘籽粕计)见表4。

表4 沙棘籽粕多酚物质组成与含量

由表4可见，芦丁含量最高，为(1.623±0.224)mg/g，没食子酸和杨梅素的含量也较高。沙棘籽粕中被检测出的多酚物质总含量为4.239 mg/g，而福林-酚法测定结果表明沙棘籽粕中多酚含量为35.9 mg/g。这是由于多酚中含酚羟基的化学结构，而蛋白质分子由于存在多种不同功能的基团，使得多酚与蛋白质之间通过非共价作用(包括氢键、离子键和疏水相互作用)结合，导致其相对分子质量较大，空间结构复杂，因未能通过超滤膜而未检出[15]。

2.4 沙棘籽粕多酚的抗氧化性

2.4.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一种以氮为中心的稳定自由基，常用于反映样品抗氧化能力强弱[21]。沙棘籽粕多酚与VC的DPPH自由基清除能力对比见图7。

图7 沙棘籽粕多酚与VC的DPPH自由基清除能力对比

由图7可见，沙棘籽粕多酚对DPPH自由基的清除作用呈明显的剂量效应，当多酚质量浓度为0.01 mg/mL时，对DPPH自由基几乎没有清除能力，但当多酚质量浓度提高到0.10 mg/mL时，对DPPH自由基清除率达到81.82%，之后继续增加多酚质量浓度，对DPPH自由基清除能力增加趋势放缓，清除率最高为90.08%，沙棘籽粕多酚和VC对DPPH自由基清除作用的半数抑制浓度(IC50)分别为0.057、0.013 mg/mL。

2.4.2 羟自由基清除能力

羟自由基是最活泼的自由基之一，几乎能与活细胞中的任何分子发生反应，反应速度快，引发组织细胞病变而导致各种疾病发生和加速机体衰老。减少此类自由基，即可达到防衰老、防心血管疾病、抗癌等作用[21]。沙棘籽粕多酚与VC的羟自由基清除能力对比见图8。

图8 沙棘籽粕多酚与VC的羟自由基清除能力对比

由图8可见，沙棘籽粕多酚质量浓度低于0.25 mg/mL时，羟自由基清除率较低，但当沙棘籽粕多酚质量浓度达到0.25 mg/mL时，羟自由基清除率达到93.92%，虽低于VC的98.75%，但沙棘籽粕多酚仍具有较好的羟自由基清除能力。沙棘籽粕多酚和VC对羟自由基清除作用的IC50分别为0.147、0.012 mg/mL。

3 结 论

在单因素实验的基础上，通过正交实验优化沙棘籽粕多酚提取的工艺条件，确定多酚的最佳提取工艺条件为：80%甲醇为提取溶剂，超声提取方式，超声频率40 kHz，超声功率150 W，料液比1∶25，提取温度20℃，提取时间20 min。在最佳提取条件下，多酚得率为(7.83±0.03)%。通过HPLC法对多酚提取液组分进行分析，共检测出6种物质，分别为没食子酸、儿茶素、芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚，其中芦丁含量最高，为(1.623±0.224)mg/g(以沙棘籽粕质量计)。抗氧化结果显示，沙棘籽粕多酚提取液具有良好的抗氧化能力。