基于Wnt、Notch信号通路分析烙灸对脊髓损伤大鼠的神经修复作用

岳倩文 夏 铂

宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004

脊髓损伤(Spinal cord injury ,SCI)是一种损害患者的脊髓结构及功能，引起运动、感觉以及自主神经功能障碍或丧失的疾病。不论是采取手术治疗，还是国际通用甲基强的松龙进行冲击治疗，都存在钠潴留，水肿及尿路感染的风险[1]。烙灸利用温热刺激促进受损伤局部气血运行，加速体液循环，针对急性病往往有意想不到的作用。烙灸是将烙铁模具中加艾绒或者其他药物作用于损伤部位，利用烙铁作为持续温热刺激传导于皮肤上，改良了督灸继发感染率高的缺点，又给予穴位以持续温热的刺激，从而达到通经活络、消瘀散结之目的。临床上在血管性痴呆、弱少精子症、骨与关节等多种疾病中发挥着良好疗效。本研究主要采用Allen’s打击模型造成大鼠急性脊髓损伤，较好的模拟了因外力冲击等外伤所造成的脊髓受损状态。通过Wnt、Notch信号通路，通过对脊髓损伤大鼠的Western Blot检测，分析烙灸疗法对脊髓损伤后大鼠的神经修复机制及是否可以促进神经干细胞增殖分化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取清洁级SD大鼠60只(宁夏医科大学实验动物中心提供，6～8周龄，体质量220～240 g，雄性)。温度(25±l)℃，湿度(50±10)%，光暗周期12 h/12 h，自由进食和饮水,常规环境适应性饲养 14d后进行实验。

1.2 主要试剂及仪器 甲基强的松龙，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，RIPA裂解液，缝合线、咬骨钳、一次性注射器、手术剪、组织剪等。Tanon-4200全自动化学发光图像分析系统、低温高速离心机(TGL—16G—A 型，上海安亭科学仪器厂)、超低温冰箱(MDF—38E2 型，日本三洋公司)、电子恒温水浴锅(DZKW-4 型，北京中兴伟业仪器有限公司)、凝胶成像系统(美国 Bio-rad 公司)。

1.3 脊髓损伤模型制备 实验随机选取大鼠进行称重，以100 mg/L水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉后，置于弓形手术台，备皮消毒，取后正中线以T10作为中点，依次切开皮肤、筋膜、肌肉，微型咬骨钳咬合T10段椎板、棘突，暴露脊髓。采用改良的Allen’s打击装置，打击锤重10 g，下落高度为5 cm，致伤量为50 g·cm-1(此致伤量可造成大鼠中等程度脊髓损伤)。当大鼠出现摆尾反应，双侧后下肢无法移动，硬脊膜内充血或水肿，则造模成功。每日两次进行挤压膀胱排尿。本实验严格按照动物伦理审查指南进行。

1.4 分组及治疗 将60只大鼠按照随机数表分为5组，每组12只。A组为假手术组，只做椎管切除，不做任何处理。B组为模型组，在造模成功过后不做治疗。C组为甲基强的松龙组，Allen’s打击30 min后按照30 mg/kg给药，之后按照5.4 mg/kg给药，连续3 d。D组为烙灸2 h组，在脊髓损伤后2 h进行烙灸。E组为烙灸12 h组，在脊髓损伤后12 h进行烙灸。除A组外，各组于Allen’s打击后腹腔注射2万μ/kg青霉素，每日1次，连续3 d，防止创面感染。术后各组予以生理盐水，连续3 d。

烙灸操作：在烙灸铁质模具中放置艾绒于D组、E组大鼠脊椎T10-T11段两侧夹脊穴(脊柱区，第8胸椎至第十二胸椎棘突下两侧，后正中线旁开0.5寸处)进行治疗(穴位定位参照《实验动物针灸穴位图谱》)，每日1次，每次5min，视皮肤发红及异常体液排出等状况而定。

1.5 取材及相关指标检测

1.5.1 组织取材 各组分别于造模成功后的第1d、7d、14d、21d进行脊髓组织提取，每组在每个时间点取3只，长度为损伤上下1cm，进行Westernblot检测，观察脊髓Wnt3a、Wnt1、Hes1、Hes5、β-catenin、Presenilin1的蛋白表达量变化。

1.5.2 Western blot检测组织研磨、RIPA裂解液进行裂解、匀浆后离心，静置提蛋白，10%分离胶电泳、转至PAGE膜、5%脱脂奶粉室温封闭1 h,孵育一抗：Wnt3a蛋白(1∶1000，Abcam公司)；Wnt1蛋白(1∶1000，Abcam公司)；β-catenin蛋白(1∶5000，Abcam公司)；Hes1蛋白(1∶1000，Abcam公司)；Hes5蛋白(1∶1000，Abcam公司)Presenilin1蛋白(1∶5000，Abcam公司)；GAPDH蛋白(1∶3000，三箭公司)。用漂洗液洗膜3次，孵育二抗 (兔二抗1∶3000，Jackon公司；鼠二抗1∶3000，Jackon公司) 放在化学发光成像仪中，曝光。

1.6 数据处理 利用Image J软件进行灰度分析。

2 结果

2.1 Wnt信号通路(图1～图3) 在Wnt1、Wnt3a、β-catenin蛋白检测中，C、D、E组间差异无统计学意义(P>0.05)。从β-catenin检测中可以看出，各组的蛋白表达量随着时间的损伤时间的延长均呈现出下降趋势；但各组蛋白表达量均高于假手术组，表明脊髓损伤后β-catenin表达增强，提示Wnt/β-catenin信号通路在脊髓损伤后被激活。

在术后7 d的检测中，C组表达量高于B组跟E组；在术后14d检测中，D组表达量高于B组跟E组。由此可以推断，2h烙灸治疗有助于脊髓损伤大鼠激活β-catenin因子。

图1 各组大鼠β-catenin蛋白表达比较

图2 各组大鼠wnt1蛋白表达比较

在Wnt1的蛋白表达量中，D组跟E组呈上升趋势，B组和C组呈下降趋势，D组、E组的蛋白表达量低于B组、C组。术后7d检测中，C组表达高于B组，B组高于E组；在术后14d，D组表达量远远低于E组。

在Wnt3a检测中，模型组蛋白表达量在上升，C、D、E组呈下降趋势。

在术后7 d检测中，B组大于E组跟D组；在术后14 d检测中，B组大于E组跟D组。提示实验中B组7 d、14dWnt3a蛋白过表达。而在术后21 d检测中，C组表达量大于D组。D组在第14天较之E组Wnt3a表达量低，提示脊髓损伤后内源性神经干细胞向损伤区域迁移，修复受损神经元。B组Wnt3a含量最低，提示Wnt3a可抑制损伤后炎症反应，帮助损伤区域的神经干细胞修复。

图3 各组大鼠wnt3a蛋白表达比较

2.2 Notch信号通路(图4～图6) 在Hes1检测中可以看出，各组的蛋白表达量随着时间的损伤时间的延长均呈现出下降趋势。

在术后7d检测中，C组高于B组、E组，提示增加了星形胶质细胞分化的可能性；在术后14d检测中D组表达量高于B组、E组。E组低表达说明烙灸下调Notch信号通路来促进其向神经干细胞分化。

图4 各组大鼠Hes1蛋白表达比较

在Hes5检测中，C、D组蛋白表达量呈下降趋势，而B组呈上升趋势，E组术后7d与术后14d表达量相同。

术后7 d检测中，C组蛋白表达量高于B组跟E组，提示增加了星形胶质细胞分化的可能性；术后14 d检测中，D组表达量高于B组、E组；在术后21 d检测中，D组高于C组。E组低表达说明烙灸下调Notch信号通路来促进其向神经干细胞分化。

在Presenilin1检测中，B组、D组呈上升趋势，C组、E组呈下降趋势。在术后7 d检测中，C组表达量高于B组、E组，提示Notch信号通路被激活。在术后14 d检测中，D组蛋白表达量高于B组、E组，提示激活Notch信号通路受到抑制，D组可能通过抑制Notch信号通路来参与脊髓损伤的神经修复。在术后21 d检测中，D组表达量高于C组。

在Hes1、Hes5、Presenilin1蛋白检测中，C、D、E组间差异无统计学意义(P>0.05)。在Hes1、Hes5、Presenilin1蛋白检测中，12 h烙灸组明显优于2 h烙灸组。

图5 各组大鼠Hes5蛋白表达比较

图6 各组大鼠presenilin1蛋白表达比较

3 讨论

3.1 烙灸疗法 中医学认为脊髓损伤是由于瘀血阻滞督脉，枢机统帅失职，三阳经气血逆乱而致，其病因为“瘀血”，病机为“督脉枢机不利”。沈金鳌在《杂病源流犀烛》谓“脊痛,督脉病也”。患者由于元阳不振，气血不调，经络堵塞造成肢体活动不利，烙灸正有此功效，它利用艾绒及器具加热所产生的温热刺激，结合腧穴组织的特点，烙烫皮肤从而激发人体体液活动禀潜能。在Wnt、Notch信号通路的相关因子检测中12 h烙灸组的蛋白表达量明显优于2 h烙灸组，提示烙灸作为一种热效应，不适合在脊髓损伤后立即应用，同时进一步明确烙灸的主要作用为活血化瘀、逐瘀生新、通经活络。

烙灸始载于《回回药方·针灸门》,“要知灸的得济处，是凡一体内，多有恶润凝聚以致本体，并其禀性作坏，若人先有之，然亦不能去净，必以火灸之，则本体病根尽去”[2]。采用补阳还五汤配合烙灸治疗脑卒中的临床病例观察中发现患者的神经功能明显优于传统内科基础治疗组[3]。在乳腺增生的疾病治疗上根据月经周期以疏肝解郁为治法的中药其治疗效果远远低于中药配合增生局部烙灸组[4]。烙灸正是利用患者病后急需通过大量热效应和强刺激的手段，增加周围神经的敏感度，加强其与大脑中枢神经的联系。

3.2 脊髓损伤的Wnt信号通路研究 信号通路被激活后可参与脊髓损伤后神经及损伤区域的修复。Wnt信号通路是目前研究就最多、最透彻的信号通路。Wnt信号通路可以刺激神经干细胞的增殖并促使其向神经元分化，抑制神经干细胞向胶质细胞的分化，促进突触的再生[5]。从术后7 d的蛋白表达量可以看出，在脊髓损伤早期Wnt1被激活后呈现高表达[6]。细胞凋亡、轴突再生、胶质瘢痕形成等病理现象是炎症产生的基础，DiLiddo[7]研究发现刺激Wnt3a可明显改变炎症因子激活Wnt信号通路抑制炎症，在SCI的病理过程中起到关键作用。Wnt3a虽然可以促进轴突再生，但过表达会抑制神经干细胞的增殖而使其过早向分化为神经元[8-9]。本实验中模型组从术后7～14d，Wnt3a表达量不断上升达到顶峰，提示模型组Wnt3a存在过表达。当Wnt/β-catenin信号通路被激活，可促进神经干细胞增殖分化为神经元[10]，而本实验除了假手术组的β-catenin表达量不变，其余各组在损伤后β-catenin蛋白表达升高，术后14天2 h烙灸组的β-catenin表达量最高，表明2h烙灸对脊髓损伤大鼠受损的神经干细胞中分化的过程中发挥主要作用。

3.3 脊髓损伤的Notch信号通路研究 Notch信号通路是神经干细胞研究中的一条极为重要的信号通路[11]，通过信号强度影响细胞的分化、增殖和存活。下调Notch信号通路会促进其向神经干细胞分化[12]，激活Notch信号通路有利于神经干细胞干性的维持[13]。Hes蛋白通过调节控制神经和神经胶质特异性基因的表达，来调节控制神经干细胞[14]。Hes1只在神经干细胞中表达，其缺失会使神经元分化增加[15-16]，其高表达会促进神经干细胞的增殖，分化为星形胶质细胞抑制神经干细胞分化为神经元[17]。Notch信号表达增强可能是脊髓损伤后限制神经功能再生的重要原因， 抑制Notch信号通路活性，可以促进脊髓损伤后功能重建[18]。在Hes1、Hes5及Presenilin1蛋白检测中，12 h烙灸组在术后7 d、14 d蛋白表达量明显低于其余各组，证实12 h烙灸治疗抑制了Notch信号通路，可促进脊髓损伤功能再生。Nicolas等[19]可知Notch信号在一定条件下具有抑制Wnt信号传导的作用，因此猜测在Wnt1及Wnt3a蛋白检测中，脊髓损伤大鼠在经过烙灸治疗后其蛋白表达量远低于模型组及甲基强的松龙组，恰恰是Notch通路对Wnt1及Wnt3a的抑制作用。因此Wnt、Notch信号通路相互影响[20]，在脊髓损伤发生后在进行烙灸后，Wnt、Notch信号通路间的作用及对通路相关因子的作用仍待进一步研究。

综上，通过检测脊髓损伤后Wnt、Notch信号通路相关因子的蛋白表达量的变化，发现烙灸可以通过调节Wnt、Notch信号通路，来实现脊髓损伤后对神经功能的重建，达到修复受损神经干细胞作用，且该疗法相较于其他治疗费用低，操作简单，便于临床推广。