苦皮藤对类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞增殖和相关细胞因子表达的影响

贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种以关节滑膜炎及自身抗体分泌为特点的慢性自身免疫性疾病[1]，其病因及发病机制比较复杂。研究认为，炎症、滑膜增生及骨破坏为RA主要的病理特征，治疗时可从抑制炎症反应、抑制滑膜细胞增殖、抑制软骨损伤和骨侵蚀几方面入手[2-3]。滑膜成纤维细胞(Fibroblast-Likessynoviocytes，FLS)在RA发病中起关键作用，在病理状态下FLS表现为异常增殖及凋亡不足，能分泌高水平促炎细胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-17，还能分泌化学趋化因子、基质蛋白降解酶等[4]。

苦皮藤CelastrusangulatusMaxim.为卫矛科南蛇藤属苦皮藤的干燥根，具有祛风除湿、活血通经、解毒杀虫的功效，可治疗风湿痹痛、骨折伤痛、疮疡溃烂等病[5-6]。苦皮藤中化学成分丰富，含有倍半萜类、三萜类、二萜类、黄酮类、生物碱类、挥发油等成分[7]。苦皮藤具有杀虫、杀菌、抗癌等活性，其中杀虫活性研究较为深入，已有成熟的杀虫制剂[8]。但关于苦皮藤抗风湿作用的研究在国内外尚无具体报道。根据文献记载[9]，苦皮藤配伍藤萝根、白金条泡酒服用可治疗风湿、劳伤、关节疼痛。由此，为验证苦皮藤的抗风湿作用，寻找其有效成分及其作用机制，可对苦皮藤进行深入研究。实验以TNF-α诱导的人类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞模型，研究苦皮藤不同提取部位的抗风湿作用，为筛选苦皮藤抗风湿有效部位及研究其作用机制提供科学依据。

1 材料

1.1 细胞株HFLS-RA类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(货号：JNO-02001)，购自广州吉妮欧生物科技有限公司。

1.2 药物制备 称取8 mg药物，充分溶于1mL DMSO中，制成8 mg/mL的母液，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，4℃条件下保存。

1.3 试剂 胰酶(+EDTA，批号：J180035，Hyclone)；南美胎牛血清(批号：JC63468，CLARK)；DMEM高糖培养基(批号：WH01111903XP，Procell)；双抗(批号：J180034，Hyclone)；MTT(批号：EZ2811A179，Biofroxx)；二甲基亚砜(DMSO，批号：SHBJ7919，Sigma)；TNF-α(货号：300-01A-10，Peprotech)；IL-1β、IL-6、MMP-3、PGE2检测试剂盒均购自上海茁彩生物科技有限公司。

1.4 仪器 倒置生物显微镜(AE31，麦克奥迪实业集团有限公司)；酶标仪(SpectraMAX Plus384，Molecular Devices)；压力蒸汽灭菌器(SYQ-DSX-280B，上海宜川仪表厂)；CO2培养箱(MCO-15AC，三洋电机国际贸易有限公司)；台式低速离心机(TDZ4-WS，长沙湘仪离心机仪器有限公司)。

2 方法

2.1 MTT法检测苦皮藤对HFLS-RA增殖活性的影响 取对数生长期的HFLS-RA细胞，PBS洗涤，胰蛋白酶消化后收集，1000 rpm离心5 min，吸除上清液，加入适量培养基使其成为单细胞悬液，调节细胞密度3.5×104/mL，200 μL/孔接种于96孔板中，每种药物分别设置空白对照组、160、80、40、20、10 μg/mL组，每组5重复，37℃、5%CO2恒温培养，待细胞贴壁后，加入对应药物。待药物分别作用24、48、72 h后，吸弃上清，每孔加入200 μL终浓度为0.5 mg/mL的MTT溶液，继续培养4 h；吸弃液体，每孔加入150 μL DMSO，避光振荡10 min，用酶标仪测定其在490 nm处的吸光度(OD)值，计算细胞的生存率。

2.2 ELISA法检测TNF-α诱导的HFLS-RA中相关细胞因子的表达 取对数生长期的HFLS-RA细胞，PBS洗涤，胰蛋白酶消化收集，1000 rpm离心5 min，吸除上清液，加入适量培养基使其成为单细胞悬液，调节细胞密度7×104/mL，2 mL/孔接种于24孔板中，24 h细胞贴壁后弃去上清液，设置空白组、模型组、样品组，每组3重复。空白组不加药物及TNF-α，模型组用不完全培养基培养预处理1 h后，加入1 mL 20 ng/mL的TNF-α，样品组分别加入质量浓度为10、40、160 μg/mL的7种不同药物1 mL，预处理1 h后，再加入1 mL TNF-α，37℃、5%CO2恒温培养，72 h后收集上清液，按ELISA试剂盒说明书检测IL-1β、IL-6、MMP-3、PGE2的含量。

3 结果

3.1 苦皮藤对HFLS-RA增殖的影响 采用MTT法测定OD值，通过公式计算细胞活力可以看出，TNF-α诱导组细胞活力最高，可以促进HFLS-RA增殖。结果表明，随着干预时间的延长，各组OD值降低，抑制率逐步升高，呈时间和剂量依赖性。药物干预24 h，与空白组比较，A、C组(10 μg/mL)，B、E组(10，20，40 μg/mL)差异均无统计学意义(P>0.05)；其余各组差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。A、E、F、G组对细胞增殖无明显抑制作用，且在较低浓度时对细胞增殖有促进作用；C、D组在高剂量下对细胞增殖有一定抑制作用(见图2)。

药物干预48 h，与空白组比较，A、B、G组(10，20 μg/mL)，F组(10，20，40 μg/mL)差异均无统计学意义(P>0.05)；其余各组差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。C、D组可明显抑制HFLS-RA的增殖(见图3)。

药物干预72 h，与空白组比较，A、E组(10 μg/mL)，F组(10，20，40 μg/mL)，G组(10，20 μg/mL)差异均无统计学意义(P>0.05)；其余各组差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。各组随着给药浓度增加，对细胞增殖均出现不同程度的抑制作用，并呈剂量依赖性，其中C、D组(160 μg/mL)对HFLS-RA的增殖有明显抑制作用(见图4)。石油醚部位作用24 h、48 h、72 h的IC50值分别为156.38、75.044、61.347 μg/mL，二氯甲烷部位作用48 h、72 h的IC50值分别为94.571、63.513 μg/mL，其余部位无法获取IC50。在ELISA实验中采用高、中、低(160、40、10μg/mL)3个剂量来考察苦皮藤各个部位对相关细胞因子的影响。

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图2 苦皮藤各个提取部位作用24h对细胞活力的影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图3 不同浓度的苦皮藤各个提取部位作用48h对细胞活力的影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图4 不同浓度的苦皮藤各个提取部位作用72h对细胞活力的影响

3.2 苦皮藤对HFLS-RA分泌细胞因子的影响

3.2.1 苦皮藤对IL-1β的影响 由表1可知，与空白组比较，TNF-α组细胞上清中IL-1β含量极显著升高(P<0.01)。与TNF-α组比较，B、C、D组(40，160μg/mL)中IL-1β含量均明显降低(P<0.05，P<0.01)，且各组对IL-1β的作用呈一定的浓度依赖关系；E组(160μg/mL)中IL-1β含量极显著降低(P<0.01)。

3.2.2 苦皮藤对IL-6的影响 由表2可知，与空白组比较，TNF-α组细胞上清中IL-6含量极显著升高(P<0.01)。与TNF-α组比较，C组(40，160 μg/mL)中IL-6含量均明显降低(P<0.05)，呈一定的浓度依赖关系；D组(160μg/mL)中IL-6含量显著降低(P<0.05)。

表1 苦皮藤不同提取部位对TNF-α诱导的HFLS-RA中IL-1β含量的影响

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与TNF-α组比较，#P<0.05，##P<0.01。

表2 苦皮藤不同提取部位对TNF-α诱导的HFLS-RA中IL-6含量的影响

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；其余组与TNF-α组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3.2.3 苦皮藤对MMP-3的影响 由表3可知，与空白组比较，TNF-α组细胞上清中MMP-3含量极显著升高(P<0.01)。与TNF-α组比较，C、D组(160 μg/mL)中MMP-3含量均明显降低(P<0.05)。

3.2.4 苦皮藤对PGE2的影响 由表4可知，与空白组比较，TNF-α组细胞上清中PGE2含量极显著升高(P<0.01)。与TNF-α组比较，C组(40，160 μg/mL)中PGE2含量显著降低(P<0.05，P<0.01)，呈一定的浓度依赖关系；A、B、D组(160 μg/mL)中PGE2含量均明显降低(P<0.05，P<0.01)。

表3 苦皮藤不同提取部位对TNF-α诱导的HFLS-RA中MMP-3含量的影响

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与TNF-α组比较，#P<0.05，##P<0.01。

表4 苦皮藤不同提取部位对TNF-α诱导的HFLS-RA中PGE2含量的影响

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与TNF-α组比较，#P<0.05，##P<0.01。

4 讨论

研究认为，滑膜成纤维细胞(FLS)在炎症反应的发展和关节破坏过程中起着重要作用，能直接破坏软骨和骨组织，是治疗RA的重要靶点[10]。FLS可合成并分泌肿瘤细胞因子、白细胞介素、干扰素、趋化因子、集落刺激因子、生长因子等多种因子，如IL-6、IL-8、PGE2、胶原酶、基质金属蛋白酶等，这些炎症介质均参与滑膜炎症反应并最终导致关节破坏[11]。本实验通过研究苦皮藤对HFLS-RA细胞增殖及分泌炎症因子的抑制能力，初步分析苦皮藤抗风湿有效部位及可能机制。

MTT法检测苦皮藤对细胞增殖活性的影响实验表明，随着时间延长及给药浓度增加，苦皮藤的水提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及剩余层部位对细胞的增殖均无明显抑制作用；石油醚部位与二氯甲烷部位对细胞的抑制率逐步升高，呈时间和剂量依赖性，当给药浓度为160 μg/mL，干预72 h时抑制率最高，抑制效果最佳，抑制率分别达到90.701%、91.318%。ELISA法检测苦皮藤对细胞分泌炎症因子含量的影响实验表明，TNF-α可诱导HFLS-RA分泌高水平的IL-1β、IL-6、MMP-3、PGE2，体现其促炎功能。石油醚部位及二氯甲烷部位(160 μg/mL)能显著抑制相关细胞因子的表达(P<0.05，P<0.01)，提示这两个部位可能通过抑制HFLS-RA分泌细胞因子，从而减少炎症因子的产生与释放；其余部位均没有明显的抑制作用。综上，苦皮藤中具有抑制HFLS-RA增殖及其分泌炎症因子能力的有效成分集中在石油醚部位及二氯甲烷部位。

苦皮藤中富含萜类成分，主要集中在小极性部位[12]。研究表明，萜类成分具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节等广泛的生物活性[13-14]。其中倍半萜类化合物可通过抑制NF-κB，MAPKs和STAT等信号通路相关因子的活化，下调TNF-α、PGE2、NO、IL-1、IL-6、IL-8等炎性因子的蛋白表达，实现抗炎作用[15]。由此推测苦皮藤抗风湿作用可能与萜类成分相关，尚待进一步实验验证。

综上所述，苦皮藤的水提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及剩余层部位对细胞增殖及相关细胞因子的表达均无明显抑制作用；石油醚部位与二氯甲烷部位可抑制HFLS-RA的异常增殖，并能够显著降低IL-1β、IL-6、MMP-3、PGE2的表达水平，为下一步探究苦皮藤抗风湿有效成分及其作用机制奠定基础。