刺参多功能表皮生长因子6(megf6)cDNA克隆及在肠再生过程中的表达分析

陈雷，姚锋，唐爽，郭良勇，王珊，方蕾，秦玉雪，尹增强，侯林*

(1.辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁 大连 116081；2.大连海洋大学 海洋科技与环境学院，辽宁 大连 116023；3.辽宁省渔港与水产种苗中心，辽宁 大连 116000)

刺参Apostichopusjaponicus隶属于棘皮动物门Echinodermata海参纲Holothuroidea楯手目Aspidochirota，是无脊椎动物中与脊索动物门Chordata种类最为接近的后口类动物类群，其所处分类地位十分特殊[1]。刺参广泛分布于西北太平洋沿岸，是中国黄渤海重要的海产经济生物[2]。当受到敌害攻击或不良自然环境影响时，如水温骤变、水质恶化、海水中病原菌大量滋生等，刺参会表现出特殊的防御机制——“吐脏”，即将大部分消化道和与之相连的器官(呼吸树、性腺、血管系统等)通过泄殖腔破裂的方式排出体外，而刺参吐出消化道后，在食道与泄殖腔的残肢部位留下2个断面[3]，经过一定时间的再生便可形成一套完整的内脏器官。一般认为，在海参内脏再生过程中既涉及变形再生，又涉及新建(发育)再生[4]。迄今为止，关于海参再生的研究主要集中在组织形态和分子水平。

多功能表皮生长因子(multiple epidermal growth factor，MEGF)是通过检测蛋白N-末端区域的EGF样结构域时而被发现的[5]，其具有与表皮生长因子(EGF)相近的结构和功能特征[6]，即都具有EGF样结构域。该结构域是进化上非常保守的模块化蛋白亚单位，一般由30～40个氨基酸残基构成[7]。已有研究证明，MEGF在胚胎发育、机体内环境稳定过程中具有重要作用，表现在调控细胞增殖、分化、凋亡、黏附、迁移等[8-9]。早期研究中已鉴定出9个megf基因家族成员(megf1～megf9)，在后期高通量筛选中又发现了3个(megf10、megf11、megf12)[10-11]。MEGF蛋白家族具有相对分子量大(>100 000)的特点，家族中MEGF1～MEGF3和MEGF7～MEGF12是膜锚定蛋白，MEGF4～MEGF6为分泌蛋白[12]。截至目前，多种生物的megf基因家族的mRNA序列已经被得到，但关于刺参中megf的研究报道非常少。基于本实验室转录组数据分析结果发现，megf6在刺参肠再生的第5、10天时表达上调，结合megf6具有调控组织细胞生长和迁移功能的已有研究结果[13]，推断megf6可能与刺参再生有一定关系。

MEGF6，又名EGFL3，是一种具有30余个egf样结构域的大分子量蛋白，megf6基因定位于人类1号染色体(1p36.32)[5]。已有研究发现，megf6基因敲除的小鼠是可正常发育的，但表达megf6的细胞可以参与皮肤表皮、大脑和肋骨的组分形成[14]；megf6在成骨样细胞中表达，并能作为血管生成因子促进血管生成[8]；也有研究证明，MEGF6与神经系统的紊乱发生有关[15]。本研究中，采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和实时定量PCR技术(Real-time quantitative PCR，qPCR)首次获得刺参megf6基因(简称为Aj-megf6)的cDNA全长序列，分析了基因的序列信息及其编码蛋白的结构特征，并探究了megf6在刺参肠再生过程中的表达变化，以期确定其生物学功能，为丰富megf6基因的研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用刺参购于大连市新长兴水产品市场，体质量为(92.0±4.0)g，饲养于大连海洋大学实验室玻璃钢水槽(85 cm×45 cm×45 cm)中，水温为(16.0±0.5)℃，盐度为30.5±1.0，pH为8.10±0.05，24 h不间断充气，每天换水一次，换水量为总水体的1/3。试验前暂养10 d，暂养期间和吐脏再生10 d后，每天投喂有机底泥和藻粉混合物(体积比1∶1)一次，投喂量为刺参体质量的5%。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备 暂养结束后取5头刺参解剖，取其肠组织，置于超低温冰箱(-80 ℃)中保存，用于基因克隆所需的总RNA提取。另取75头刺参通过体腔注射2 mL、0.35 mol/L KCl溶液，刺激排出内脏后用于再生试验。刺参吐脏后24 h为再生1 d，在再生3、6、9、12、15、18、21 d时，分别取5头刺参解剖，观察肠的形态变化后取出再生肠，置于超低温冰箱(-80 ℃)中保存，用于qPCR所需的总RNA提取。

1.2.2 总RNA的提取及cDNA的获得 采用Trizol 试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，按照产品说明书进行各时期肠样品的总RNA提取，并按照柳林等[16]的方法对总RNA的完整性进行检测，并将完整性好的总RNA样品在oligo(dT)引物和MLV反转酶(大连TaKaRa公司)参与下进行反转录反应，获得cDNA样品，并于冰箱(-20 ℃)中保存备用。

1.2.3Aj-megf6基因EST序列的获得 从NCBI(National Center for Biotechnology Information)中下载刺参megf基因家族的EST序列，并利用Primer Premier 6.0软件设计上下游引物，交由上海捷瑞生物工程有限公司进行引物合成。本试验所用引物序列见表1。PCR反应体系(20 μL)：ddH2O 12.8 μL，cDNA样品1 μL，10×Easy Taq Buffer(+Mg2+)2 μL，dNTP Mixture 2 μL，上、下游引物各1 μL，Easy Taq DNA Polymerase 0.2 μL。PCR反应条件为：94 ℃下预变性1 min；94 ℃下变性30 s，49 ℃下退火复性30 s，72 ℃下延伸1 min，共32个循环；最后在72 ℃下再延伸10 min。利用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的质量；利用DNA回收试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)回收、纯化PCR产物中的目标片段，并与pEASY-T1载体(北京索莱宝科技有限公司)连接后，转入Trans5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)中，先后在液体、固体培养基中扩繁，挑取单个菌落，使用M13上、下游引物(表1)进行菌液PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，将阳性克隆样品送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果于NCBI在线工具中进行比对，得到Aj-megf6基因的EST序列。

1.2.4Aj-megf6基因cDNA全长序列的获得 以获得的megf6基因EST序列为基础，利用Primer Premier 6.0软件设计5′、3′ RACE引物(表1)，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。按照SMARTer®RACE 5′/3′试剂盒(Clontech实验室，美国)说明书进行5′、3′ RACE模板的制备。RACE反应体系(50 μL)：5′或3′ RACE模板2.5 μL，UPM(10×)5.0 μL，5′或3′引物1.0 μL，ddH2O 34.5 μL，Advantage 2 PCR Buffer(10×)5 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，Advantage 2 Polymerase Mi(50×)1 μL。反应条件：94 ℃下变性5 s，68 ℃下退火复性10 s，72 ℃下延伸3 min，共进行28个循环。PCR产物的检测、回收、纯化及测序方法同EST序列。利用DNAMAN软件对EST、5′端、3′端序列进行拼接，得到Aj-megf6基因的cDNA全长序列，并利用NCBI中的BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对分析。

表1Aj-megf6基因克隆和qPCR用引物序列

Tab.1 Nucleotide sequences of primers used forAj-megf6 genes cloning and for qPCR

引物primer序列sequence(5′-3′)退火温度Tm/℃用途purposeAj-megf6F:CAGATTGTAACTGCTATGATGGCR:GCATGTATCTCCAGTAAATCCTGCTCTCTGTACAATCTTGGCCCCTCACCATAGTAACCTGCCAAACAAGTAGGGCTACATTGCTGACCGTTACAGATAGTTCCGGTCCAGCCAGCAGTTCATAGCCATGTCTACACGCCATTACGCAACGCACAAGGATTGAGGATGCCAAGAAGGAAGATTTTAAATGGAGGCCGTTGTGACAGAF:CGGTCCTTACTGTGCGGAGAR:CGTCCTCCCAGCTGGACATC49EST555′RACE-1555′RACE-2555′RACE-3555′RACE-4555′RACE-5555′RACE-6553′RACE-1553′RACE-260qPCRAj-gapdhF:GACCGAGCGCAAAGAAGTGGR:ACGGAAGGCCATGCCAGTAA60qPCRM13F:TGTAAAACGACGGCCAGTR:TCACACAGGAAACAGCTATGAC49菌液PCR

1.2.5Aj-megf6基因的生物学信息分析 生物信息学分析按照孙冉冉等[17]对黄条鰤pten基因生物信息学分析时采用的方法进行。利用ClustalX和 DNAMAN 9.0软件对Aj-MEGF6和选取的其他18个物种MEGF6的氨基酸序列、MEGF家族中39条氨基酸序列进行多序列比对，并利用MEGA 4.1软件构建基于邻接法(Neighbor-Joining, NJ)的系统进化树(重复计算1000次)。

1.2.6 肠再生过程中Aj-megf6的表达分析 提取刺参再生过程中各时期(再生3、6、9、12、15、18、21 d)肠组织的总RNA，反转录获得相应的cDNA样品，并稀释浓度至100 ng/μL。按照SYBR Premix Ex Taq试剂盒(大连TaKaRa公司)说明书进行qPCR，检测Aj-megf6基因的表达水平。以正常未吐脏刺参的肠为对照组，选取刺参的gapdh基因为内参基因(表1)，Aj-megf6基因的扩增片段长度为171 bp，gapdh基因的扩增片段长度为134 bp。反应体系(25 μL)：SYBR®Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μL，Forward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，cDNA样品2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。使用Applied Biosystems StepOnePlus Real-time PCR System、两步法PCR扩增标准程序，第1步，95 ℃下预变性30 s；第2步，95 ℃下变性5 s，60 ℃下退火30 s，共进行40个循环。每个样品设3个重复。采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

1.3 数据处理

试验数据以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，利用SPSS 19.0软件对数据进行单因素方差分析，用 LSD法进行多重比较，显著性、极显著性水平分别设为0.05、0.01。

2 结果与分析

2.1 Aj-megf6全长cDNA序列和生物信息学分析

刺参megf6基因cDNA全长序列为5665 bp，由389 bp的5′端非编码区(5′ Untranslated region, UTR)、4815 bp的开放阅读框序列和461 bp的3′端非编码区组成。开放阅读框序列共编码1604个氨基酸，具有37个EGF样结构域(图1)。利用ProtParam tool of ExPASy分析预测Aj-MEGF6蛋白的相对分子质量为172 500、等电点为4.74。对该蛋白的亲、疏水性预测分析得到，其平均值为-0.486(最大值3.389，最小值-2.700)，表明该蛋白可能是亲水性蛋白。用NetPhos 3.1 Server分析预测该蛋白共有53个磷酸化位点，其中有23个Ser位点、12个Thr位点、18个Tyr位点。Aj-MEGF6蛋白具有信号肽，为分泌蛋白，但不具有跨膜结构，属于非跨膜蛋白。Aj-MEGF6蛋白的二级结构预测显示，有173个α螺旋、286个延伸链、197个β转角和948个无规则卷曲。

2.2 Aj-MEGF6序列同源性比对及系统进化树构建

通过多序列比对，刺参与其他18个物种的MEGF6氨基酸序列的一致性为38.59%～49.07%，其中与紫球海胆S.purpuratus的一致性最高，为49.07%，与长棘海星A.planci次之(48.71%)。利用ClustalX和MEGA 4.1软件，以19种生物的MEGF6氨基酸序列构建了NJ系统进化树(图2)，结果显示，19种生物聚为两支，一支为脊椎动物，另一支为无脊椎动物。在无脊椎动物中，刺参与长棘海星、紫球海胆聚为一个分支，这符合刺参为棘皮动物的分类地位。利用Aj-MEGF6与MEGF家族中39条氨基酸序列构建的NJ系统进化树显示，同类MEGF的多个物种聚为一支，表明MEGF家族成员间具有一定的分化(图3)。

2.3 再生过程中肠的形态变化

刺参吐脏后，消化道前、后端分别在食道与胃部连接处、肠与泄殖腔连接处断裂，在体内留下食道及泄殖腔的残体。再生3～21 d时肠管逐渐增长；再生15 d时肠管前后贯通呈直线型，并有食物出现；再生18 d时肠形成绕环现象，外部形态已近似正常刺参状态(图4)。

2.4 肠再生过程中Aj-megf6基因的表达分析

在刺参肠再生过程中，megf6基因的相对表达量呈先升高后降低的趋势，其中在再生6 d时达到峰值，为对照组的126.47倍；自再生6 d后，表达量呈下降趋势；再生过程中，除了再生18、21 d时megf6基因表达水平与对照组无显著差异外，在其他时期均有显著或极显著性差异(P<0.05或P<0.01)(图5)。

3 讨论

3.1 刺参megf6基因的序列特征

本研究中，利用RACE技术首次克隆得到了成体刺参megf6基因的cDNA全长序列。生物信息学分析显示，该序列中开放阅读框为4815 bp，共编码1604个氨基酸。Aj-MEGF6包含37个EGF样结构域，这与Letunic and Bork利用SMART蛋白质注释工具对MEGF6结构域的分析结果相符合[12]。通过与18种其他生物的MEGF6氨基酸序列比较发现，19种生物的MEGF6氨基酸数量为1379～1717，刺参MEGF6的氨基酸序列与同源性最高的紫球海胆MEGF6相比，多出146个氨基酸，与长棘海星相比，多出225个氨基酸，与脊椎动物的MEGF6相比，氨基酸数量差值为-113～140，未表现出明显规律。通过多序列比对，刺参与其他18种生物的MEGF6氨基酸序列的一致性为38.59%～49.07%，其中与紫球海胆的一致性最高，为49.07%，与长棘海星次之(48.71%)；构建的NJ系统进化树显示，刺参与紫球海胆、长棘海星聚为一个分支。这些结果表明，MEGF6在生物进化中具有一定的保守性，并且符合刺参与紫球海胆、长棘海星为棘皮动物的分类地位。MEGF家族成员间比对分析表明，MEGF1～MEGF12间具有比较明显的分化现象。

3.2 megf6在刺参肠再生过程中的表达模式

再生是一个与发育类似的复杂过程，也是一个多基因调控的生理现象。有关海参吐脏再生的机制目前认为有两种，即变形再生和新建(发育)再生。变形再生指海参排脏后的残留组织自身重建形成新的组织器官，而相应的细胞是通过分化、迁移完成的，不涉及细胞增殖和分裂活动。新建(发育)再生指再生过程中有细胞的分裂、增殖发生，新生细胞取代了原有的部位而形成一个新的胚基[18]。这两种再生机制会因海参种类的不同而表现出差异性，其中刺参的肠再生涉及的机制应是两种相融合的情况[4]，而早期以变形再生(迁移)为主，后期以新建再生(增殖)为主[19]。

本研究中发现，megf6基因在刺参肠再生过程中显著上调，其中再生6 d时达到峰值，再生18 d时，其表达水平下降至正常水平。根据王霞等[20]对刺参消化道再生的研究结果，6 d时正是刺参吐脏后，食道与胃部断裂处、肠系膜断裂处的伤口愈合及原基形成阶段，有大量细胞分化和增殖现象发生。另有研究发现，在刺参肠再生第3天时，浆膜层、结缔组织层中增殖细胞比例不到3%，而再生第7天时，细胞增殖现象明显，约占细胞总数的29.5%，再生第14～21天时，细胞分裂活动减弱，肠腔上皮细胞分裂率下降至14.2%[19]。而在另一种海参Holothuriaglaberrima的再生研究中也发现类似规律，再生6 d时增殖细胞所占比例最高，为12%，再生12 d时下降至6%，并在再生后期逐渐下降[21]。本研究中，通过形态观察发现，再生过程中的肠管随时间而逐渐延长，再生15 d时再生肠管前后贯通，刺参具有摄食和消化行为；再生18～21 d时肠管进一步生长及复杂化。Aj-megf6基因表达量的变化趋势与肠细胞增殖活动、肠管形态变化相吻合，推断Aj-megf6基因与刺参肠再生活动密切相关。

3.3 megf6在刺参肠再生过程中的作用机制

肠再生过程中，肠系膜的形态变化往往被认为是消化道再生的关键环节[20]。肠再生初期，肠系膜的游离端出现增厚现象，增厚过程涉及体腔上皮细胞的去分化、细胞增殖、再分化[20]。形成肠管的细胞主要是肠腔上皮细胞及肠系膜增厚区的间充质细胞[22]。已有研究表明，megf6具有调控组织细胞生长、迁移、黏附、变性的功能[13，15]，其调控过程中涉及的CDH1(E-钙黏蛋白1，cadherin 1)可介导基底膜细胞间的连接，其异常表达会降低细胞间的黏附作用，使细胞易与周围组织分离[23]。CDH1缺失会促进细胞生长、增殖及转移[24]，而诱导上皮间充质细胞转化(EMT)是其重要机制之一[25]。已有研究表明，SNAI家族(Snail and Slug)是CDH1的抑制因子之一[26-27]。megf6基因敲除可以显著抑制SNAI2的mRNA表达，而且癌症基因组图谱(TCGA)显示，megf6 mRNA的表达与SNAI2的表达呈正相关关系[28]。megf6可以通过转化生长因子β(TGFβ)/SMAD信号途径介导，下调Slug而抑制EMT；当megf6诱导Slug表达可以促进EMT，引起细胞的转移，而且间充质细胞是具有自我更新和多向分化潜能的，是正常发育、伤口愈合的基础[28]。刺参再生肠腔上皮层是来自肠系膜增厚处的间充质细胞[19]，因此，推测在刺参肠再生过程中，megf6基因高表达时，上调CDH1的相关抑制因子表达，促进了上皮细胞向具有间质表型的细胞转化，为实现肠组织的再生重建提供了细胞来源。随着再生肠管的生长延伸，再生18 d时，刺参再生肠管已基本恢复至正常状态，megf6的表达下调时，肠管中细胞的增殖、分化活动减弱。