杜仲健骨方对大鼠骨质疏松症作用机制研究

邢威,陈雁雁,王树人,王艳丽,王文姌,张洪财,孙秋

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040； 2.黑龙江护理高等专科学校，黑龙江 哈尔滨 150301； 3.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江 哈尔滨 150040)

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种全身性、骨代谢性骨骼疾病。主要表现为骨组织显微结构破坏的全身性骨量减少。本病多发于中老年，尤其是绝经期后女性为高发人群，提示本病的发生与雌激素水平密切相关。文献报道，OP患者群骨脆性增加，加重腕关节、脊柱和髓关节[1-2]骨折风险。随着社会的进步，人口寿命的增加、结构的改变，人口趋于老龄化，发病率呈上升趋势，对OP患者的健康构成威胁[3]。骨质疏松症根据其病因病机以及临床所表现等可以归属于中医学中的“骨痹”、“骨痿”范畴[4-5]。

根据中医“肾主骨生髓”、“久病及肾”、“肾虚是骨质疏松症的病理基础”等理论，拟定出临床有效的经验方杜仲健骨方。杜仲健骨组方：杜仲、淫羊藿、补骨脂、怀牛膝。方解：杜仲、淫羊藿补肾阳、强筋骨，肾阳推动精血运行，共为君药。补骨脂、怀牛膝温肾助阳，共为臣药。诸药合用，共奏补肾阳、填髓健骨之功效。本课题组前期预实验证实：大鼠体质量增加与骨矿密度成正相关,能够降低骨折的风险；子宫指数明显升高,提示该方可能有类激素样作用,可预防因卵巢切除或卵巢功能下降。这与此前运用补肾健筋骨法治疗骨质疏松症的报道相符[6-8]。本研究通过测定骨组织Wnt3a、β-catenin基因、蛋白表达，探讨杜仲健骨方对大鼠骨质疏松症的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

SD大鼠，体质量(200±20) g，雌性，来源于黑龙江中医药大学药物安全性评价中心(GLP)，生产许可证号：SCXK(黑)2018-007。适应性饲养1周。

1.2 药品与试剂

杜仲健骨方：杜仲35 g、淫羊藿25 g、补骨脂15 g、怀牛膝15 g组成，均由黑龙江中医药大学附属第一医院中药局提供，并由黑龙江中医药大学药学院孙慧峰教授鉴定为正品；阿仑膦酸钠片(扬子江药业集团提供，国药准字：H20065637，产品批号：190124)；血清碱性磷酸酶(ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、骨钙素(OC)和I型原胶原N-端前肽(PINP)测定试剂盒(上海哈研生物科技有限公司，产品批号：201903)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京诺博莱德科技有限公司)；裂解液 RL、RIPA 裂解液(北京百泰克生物科技有限公司)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(上海康朗生物科技有限公司)；PVDF膜(英国Whatman)；抗体及上、下游引物(美国Invitrogen公司)。

1.3 主要仪器

Bio-Rad iQ5实时荧光定量PCR仪(美国伯乐)、Western blot电泳槽、垂直电泳系统(美国 Bio-Rad公司)；KHW-S-8数显恒温水浴锅(杭州亿捷科技有限公司)；Varioskan LUX多功能酶标仪(美国 Thermo公司)；MEDIX90双能X线测量仪(法国Medlnk公司)。

2 方法

2.1 模型的制备与分组给药

按照文献[9-11]方法并略加改进制备大鼠骨质疏松症模型，取3%戊巴比妥钠溶液(40 mg/kg)腹腔注射，待大鼠麻醉后，在剑突下剪毛(面积约4 cm×3 cm)；用75%(φ)酒精对手术部位进行消毒，于剑突下1.5 cm处，沿腹白线做纵向切口(约2 cm)，暴露腹腔。寻找肾脏后下脂肪团，提出卵巢，结扎输卵管及血管。去卵巢组完整摘除双侧卵巢；假手术组取出卵巢周围等量脂肪组织。最后羊肠线逐层缝合。云南白药处理外伤，肌肉注射20万U青霉素，防感染，连续5 d。术后8周，随机选取10只麻醉，取右侧股骨，双能X线骨密度测量仪检测造模情况。造模成功后，随机分成6组：杜仲健骨方高中低剂量、阿仑膦酸钠(阳性药组)、模型组、假手术组。各组大鼠(除假手术组)灌胃给药56 d，末次给药后，股动脉采血。

2.2 骨密度检测

将右侧股骨剔除软组织，双能X线骨密度测定仪测定骨密度值，小动物BMD测试软件分析。

2.3 血清ALP、TRAP、OC和PINP测定

大鼠经腹腔麻醉，主动脉采血5 mL，室温静置1 h后， 3 000 r/min，离心10 min，收集上清液，分装到EP管中，采用酶联免疫测试方法(ELISA)检测血清ALP、TRAP、OC和PINP含量。

2.4 实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测骨组织Wnt3a、β-catenin mRNA表达

取右侧股骨组织，按10～20 mg加入400 μL 裂解液 RL抽提骨组织总RNA,采用紫外分光光度计测定样品吸光值(设定波长260和280 nm)，A260/280在1.8～2.0范围内符合要求，计算RNA质量。引物序列设计，由哈尔滨维科生物科技有限公司合成(见表1)，取3 μg总RNA，用逆转录试剂盒逆转录后PCR反应检测β-catenin mRNA、反应条件：45 ℃ 30 min；90 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s；50 ℃ 45 s，40个循环。

表1 引物及探针序列Table 1 Primer and probe sequences

2.5 蛋白免疫印迹法(Western blot)法检测骨组织Wnt3a、 β-catenin 蛋白表达

将左侧股骨用液氮研磨至粉末状，加入细胞裂解液，震荡使组织充分裂解，4 000 r/min 离心10 min，得骨组织蛋白，经 BCA 法测定蛋白浓度。40 μg 蛋白上样到 20%的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳(浓缩胶为 70 V，0.5 h；分离胶为 110 V，1 h)，分离的蛋白转膜(80 V，30 min)，使用5%的脱脂奶粉封闭2 h 后，Wnt3a、β-catenin 抗体加入一抗4 ℃孵育过夜，次日1×TBST 洗3次，洗膜后孵育HRP标记的山羊抗兔第二抗体，室温孵育 1 h，染色，胶片曝光，显影，定影，软件测定灰度值。

2.6 数据处理

3 结果

3.1 各组大鼠骨密度的结果

与假手术组比较，模型组骨密度显著降低(P<0.01); 与模型组比较，杜仲健骨方高、中、低剂量组、阳性药组骨密度明显增加(P<0.01或P<0.05)。通过表2结果可见，去除大鼠双侧卵巢建立骨质疏松症模型成功，阳性药阿仑膦酸钠治疗效果最好，杜仲健骨方治疗效果次之。

表2 各组大鼠骨密度值Table 2 Bone mineral density of rats in each group(n=10)

与假手术组比较：##P<0.05； 与模型组比较：＊P<0.05，＊＊P<0.01。

3.2 各组大鼠血清 ALP、TRAP、OC、PINP测定结果

见表3。与假手术组比较，模型组血清各指标差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)；杜仲健骨方高、中、低剂量组、阳性药组大鼠血清中 ALP 、TRAP、PINP、OC含量与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。

3.4 各组骨组织Wnt3a、β-catenin 蛋白表达

与假手术组比较，模型组大鼠骨组织Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平降低(P<0.05，P<0.01)。 各给药组与模型组比较Wnt3a、β-catenin 蛋白表达水平升高(P<0.05，P<0.01)。见表 4、图1。

3.3 各组骨组织Wnt3a、β-catenin mRNA的表达

结果见表5。与假手术组比较，模型组各指标差异有统计学意义(P<0.01)；杜仲健骨方高、中、低剂量组、阳性药组的Wnt3a 、β-cateninm RNA表达水平与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。

表3 各组大鼠ALP、TRAP、OC、PINP结果Table 3 Results of ALP,TRAP,OC and PINP in each group

与假手术组比较：##P<0.01； 与模型组比较：＊P<0.05，＊＊P<0.01。

表4 各组骨组织Wnt3a、β-catenin 蛋白表达水平Table 5 Expression of Wnt3a and β-catenin protein in bone tissue

与假手术组比较：#P<0.05,，##P<0.01； 与模型组比较：＊P<0.05，＊＊P<0.01。

表5 骨组织Wnt3a、β-catenin mRNA的表达水平Table 4 Expression of Wnt3a and β-catenin mRNA in bone tissue

与假手术组比较：##P<0.01； 与模型组比较：＊P<0.05，＊＊P<0.01。

A.假手术组； B.模型组； C.杜仲健骨方低剂量； D.杜仲健骨方中剂量； E.杜仲健骨方高剂量； F.阳性药组。

图1 各组骨组织Wnt3a、β-catenin 蛋白的表达

Figure 1 Expression of Wnt3a andβ-catenin protein in bone tissue

4 讨论

中医学古典文献里没有“骨质疏松症”的记载，现代中医学者将其归为“骨枯”、“骨痿”的范畴，肾虚是其根本病因[12]。大多群体为老年人及绝经后妇女，症状为四肢酸软、骨折、腰背疼痛等。临床中常用双膦酸盐类、雌激素类、降钙素类药物，这些药物治疗效果一般[13-14]。因此，寻找安全有效低毒药物成为迫切需求。本人根据多年临床经验，拟定的验方杜仲健骨方，符合中医药“补肾健骨”理论，临床疗效显著，且不良反应少。为阐明该方剂的作用机制，本实验考察大鼠血清ALP、TRAP、OC和I型原胶原N-端前肽(PINP)含量，检测骨组织Wnt3a、β-catenin mRNA和蛋白表达情况，为中医药临床治疗骨质疏松症提供理论依据。

骨密度(BMD)是诊断骨质疏松症公认的“金标准”。 本实验检测各组大鼠股骨骨密度，发现模型组与假手术组比较显著降低(P<0.01)，说明复制骨质疏松症模型成功，给药后骨密度值显著提高。模型大鼠血清TRAP含量升高、ALP含量降低，表明骨代谢状态异常。给药后，杜仲健骨方中、低剂量组与模型组比较有显著差异(P<0.05)，杜仲健骨方高剂量组与模型组比较有极显著差异(P<0.01)，证实了该方剂能够促进骨形成。

Wnt是2个基因 Wg(wingless)和Int的合称。Wnt 蛋白由19种蛋白组成，包括 Wnt1、Wnt3a、Wnt7b等[15]。最早发现于果蝇和脊椎动物体中。都参与胚胎、器官的发生，具有同源性。Wnt信号通路对细胞分化、增殖和凋亡过程具有调节作用，影响细胞生命进程[16]。在阻断剂和诱导剂的影响下，Wnt信号通路能够影响骨髓间充质干细胞定向成骨分化的能力，同时调节破骨细胞、成骨细胞的平衡过程。Wnt信号通路在骨重建过程中起调节作用，是骨质疏松重要病理基础[17-19]。骨形成的关键调节因子为β-catenin，其表达水平和骨形成呈正相关。在Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin发挥了重要作用，其在胞质中积累继而向胞核的转位，被认为是该信号通路被激活的标志[20]。β-catenin表达水平降低使血清ALP增加，骨密度降低导致骨质疏松症发生[21-22]。本实验结果表明杜仲健骨方各剂量组均能提高大鼠骨组织Wnt3a mRNA和蛋白表达水平。杜仲健骨方高、中剂量组均能提高大鼠骨组织β-catenin mRNA和蛋白表达水平。杜仲健骨方剂量组与模型组比较Wnt3a、β-catenin 蛋白表达水平升高，说明该方剂是通过Wnt/β-catenin信号通路来发挥治疗骨质疏松症的作用，作用机制有待深入研究。