生长条件对肉桂叶精油含量、组成及抑菌活性的影响

张笮晦， 童永清， 黄广智， 毕良武

(1.广西中医药大学 药学院，广西 南宁 530200；2.广西庚源香料有限责任公司，广西 东兴 538100； 3.广西中药药效研究重点实验室，广西 南宁 530200；4.中国林业科学研究院 林产化学工业 研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业和草原局林产化学工程重点 实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室，江苏 南京 210042)

肉桂(CinnamomumcassiaPresl)为樟科樟属植物，又名玉桂，原产于斯里兰卡，中国广西、广东、云南、海南、福建等地也有种植，其中广西、广东为主产区[1]。肉桂作为我国传统的中药材，具有补火助阳、散寒止痛、引火归元等传统功效，现代研究[2-3]表明其还有抗菌、抗炎、抗肿瘤及双向调节体温等作用。肉桂叶含精油1.0%左右，肉桂叶精油化学成分复杂，主要成分为反式肉桂醛、顺式肉桂醛、邻甲氧基肉桂醛、邻甲氧基苯甲醛和乙酸肉桂酯等，其中含量最高的为反式肉桂醛[4-6]。Duan等[7]的研究表明肉桂叶精油具有抗菌作用，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠道沙门菌、枯草芽孢杆菌等有抑制作用。目前，国内外有关肉桂叶精油的研究主要集中在化学成分和药理药效方面[8-10]，而对肉桂生长条件(如生长环境、肉桂树龄)、采收月份及仓储时间等因素的研究较少，相关基础研究数据极为缺乏。笔者的前期研究[11]表明肉桂的生长环境和生长年限对肉桂出油率、挥发油成分及抑菌活性均有一定影响。因此，本研究以不同生长条件的肉桂叶为研究对象，采用水蒸气蒸馏法提取精油，对比精油含量差异；利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)测定各精油的化学组成；采用滤纸片法对其抑菌效果进行评价，以期为阐明肉桂生长条件对肉桂叶精油品质的影响提供依据，也为肉桂的科学种植及肉桂叶的科学采收提供参考。

1 实 验

表1 不同生长条件的样品Table 1 Samples of different growth conditions

1)G:常规general planting; S:疏植sparse planting; C:密植close planting

1.1 原料、试剂与仪器

肉桂叶(表1)采自广西东兴市广西庚源香料有限责任公司林场不同片区，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的叶，采集时间为2018年9月20日。样品阴干放置60 d，备用。

庆大霉素药敏纸片，含药量10 μg/片，杭州微生物试剂有限公司；营养琼脂，北京奥博星生物技术有限责任公司；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538、大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC25922、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC27853，购买于广东省微生物菌种保藏中心；石油醚、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇、乙醇和二甲基亚砜等试剂均为分析纯。

SW-CJ-1FD型洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；YX-24LDJ型手提式压力蒸汽灭菌锅，江阴滨江医疗设备有限公司；SPX-B型生化培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；SXKW型数显控温电热套；QP2010型气相色谱-质谱联用(GC-MS)仪，日本Shimadzu公司。

1.2 肉桂叶精油的提取

分别称取不同生长条件的7组肉桂叶各100 g，剪碎，置于挥发油提取装置中，加入纯水1 L，浸泡1 h，水蒸气蒸馏提取5 h，静置分液，无水硫酸钠干燥，得到相应的肉桂叶精油。每组设3个平行实验，取其平均值即为该组肉桂叶精油得率。将每组的3份油样合并，用移液枪分别取合并后的7份肉桂叶精油各100 μL，丙酮定容于2 mL容量瓶，待GC-MS分析。

1.3 肉桂叶精油的成分分析

按照文献[12]的色谱条件和质谱条件对7份样品进行分析，结果与NIST标准质谱库比对，分析鉴定各类化学成分，以峰面积归一化法计算各成分的GC含量。

1.4 抑菌活性测定

按照文献[13]中滤纸片法，选择金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)、绿脓杆菌(P.aeruginosa)为供试菌种。分别将7份肉桂叶精油用无水乙醚配制成质量浓度500 g/L样品溶液，用移液枪各滴加10 μL样品溶液于不同菌种的培养基平板中间贴双层已灭菌滤纸片(d=6 mm)上，以溶剂乙醚作为空白对照，含药量为10 μg的庆大霉素作为阳性对照。将各平板置于恒温箱中37 ℃下培养24 h后观察各样品的抑菌效果，采用十字交叉法测量抑菌圏直径。每个样品做3个平行实验。

1.5 数据处理和统计分析

肉桂叶精油的提取和抑菌试验，每组均设3个平行实验，结果表示为平均值±标准偏差。采用Excel 2010软件处理和分析实验数据，以P<0.05为差异显著。

2 结果与讨论

2.1 肉桂叶精油得率分析

图1 不同生长条件的肉桂叶精油总离子流图Fig.1 Total ion flow diagram of cinnamon leaves oil from different growth conditions

7种生长条件(No.1～No.7)下肉桂叶精油得率分别为1.25%、0.64%、1.60%、1.34%、1.20%、0.55% 和0.51%。由数据可知，肉桂叶精油得率受肉桂树龄的影响最为显著，5年生(No.1)肉桂叶与15年生(No.3～No.5)的精油得率远高于10年生(No.2)与20年生(No.7)肉桂叶精油得率。这与朱羽尧等[14]报道的肉桂叶出油率0.48%有所差异，原因可能与产地、肉桂叶采摘月份及存放时间等因素有关。肉桂种植坡向的影响也比较明显，15年生南坡(No.5)肉桂叶精油得率1.20%明显高于15年生北坡(No.6) 0.55%，坡向对肉桂叶精油得率的影响与莫开林等[15]得到的阳坡油樟在高峰期精油得率要比阴坡的高这一结论相似。广西防城港地区肉桂多种植在南坡，每年秋季肉桂叶通常从9月底开始采收。从15年生(No.3～No.6)肉桂叶精油得率上看，目前防城港地区肉桂的种植坡向和肉桂枝叶的采收月份是比较科学的。肉桂种植密度的影响最小，15年生疏植(No.3)肉桂叶精油得率1.60% 略高于15年生密植(No.4)。

2.2 肉桂叶精油成分分析

对不同生长条件的7份肉桂叶精油进行GC-MS分析，鉴定出各样品成分的总流离子图，见图1。利用峰面积归一化法计算各化合物GC含量，分析鉴定结果见表2。从7份肉桂叶精油样品中共鉴定出28个组分，其中，5年生(No.1)、10年生(No.2)、15年生疏植(No.3)、15年生密植(No.4)、15年生南坡(No.5)、15年生北坡(No.6)、20年生(No.7)肉桂叶精油分别鉴定出9、11、21、7、7、9和19种组分，总GC含量分别为89.47%、89.37%、96.61%、95.93%、92.48%、95.99%和95.34%。7份油样中共有组分有4种，分别为苯甲醛、苯丙醛、顺式肉桂醛和反式肉桂醛；精油中含量最高的成分均为反式肉桂醛，其中15年生密植(No.4)肉桂叶精油中反式肉桂醛GC含量高达90.26%，除10年生(No.2)肉桂叶精油中反式肉桂醛GC含量较低(67.73%)外，其余6份样品均符合国标GB 1886.207—2016中国肉桂油中对于反式肉桂醛GC含量(≥74.00%)的规定。此外，肉桂油中的常见成分邻甲氧基肉桂醛、乙酸肉桂酯和香豆素的GC含量在不同生长条件的肉桂叶精油中差异显著，15年生疏植(No.3)肉桂叶精油中邻甲氧基肉桂醛GC含量最高(13.31%)，10年生(No.2)肉桂叶精油中乙酸肉桂酯GC含量最高(5.74%)，而香豆素只在9月采摘的20年生(No.7)肉桂叶精油中检出，其GC含量为3.87%。

表2 不同生长条件肉桂叶的精油成分Table 2 Volatile compounds identified in the cinnamon leaves from different growth conditions

2.3 抑菌活性比较

在不同菌种的培养基平板上出现了大小不一的抑菌环，抑菌活性测定结果见表3。

表3 不同生长条件肉桂叶精油的抑菌活性1)Table 3 Antimicrobial activities of cinnamon leaves oil from different growth conditions

1)不同小写字母表示差异显著(P<0.05) different lower-case letters indicate significant differences(P<0.05)

总的来说，不同生长条件的肉桂叶精油对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，对大肠杆菌的抑制次之，而对绿脓杆菌的抑制最弱，其抑菌圈直径范围分别为22.57～39.63 mm、27.58～34.31 mm和16.39～23.89 mm。其中20年生(No.7) 肉桂叶精油对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，抑菌圈直径为39.63 mm；15年生密植(No.4)肉桂叶精油对大肠杆菌的抑制作用最强，抑菌圈直径为34.31 mm；5年生(No.1)肉桂叶精油对绿脓杆菌的抑制作用最强，抑菌圈直径为23.89 mm。此外，7份样品对这3种菌种的抑制作用强弱排序不完全一致。

3 结 论

3.1树龄对精油得率的影响最大，15年生疏植(No.3)精油得率最高(1.60%)，20年生(No.7)最低(0.51%)；其次是坡向的影响，15年生南坡(No.5)精油得率(1.20%)显著高于15年生北坡(No.6, 0.55%)；种植密度影响最小，15年生疏植(No.3, 1.60%)略高于15年生密植(No.4, 1.34%)。

3.2不同生长条件肉桂油精油共鉴定出28种化学成分，其中15年生疏植(No.3)的精油成分最多(21种)，15年生密植(No.4)和15年生南坡(No.5)最少，均为7种。反式肉桂醛均为其中GC含量最高的成分，在No.4精油中GC含量最高(90.26%)，在10年生(No.2)中GC含量最低(67.73%)。

3.3500 g/L肉桂叶精油样品均对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑制效果较好，对绿脓杆菌的抑制较弱，抑菌圈直径分别为22.57～39.63 mm， 27.58～34.31 mm和16.39～23.89 mm。20年生(No.7)肉桂叶精油对金黄色葡萄球菌抑制作用显著，抑菌圈直径39.63 mm。