结直肠癌小鼠模型研究进展

2020-05-03苗晋鑫宋韶鹤李秀敏

中国实验动物学报 2020年2期

苗晋鑫，宋韶鹤，李秀敏

(1. 河南中医药大学，中医药科学院，郑州 450000； 2. 河南中医药大学第一附属医院，药学部，郑州 450000； 3. 纽约医学院，微生物与免疫学系，耳鼻喉系，纽约 10595)

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是世界上第三大常见恶性肿瘤。在中国结直肠癌发病率和死亡率占恶性肿瘤排名第3名和第5名[1]。研究CRC发病机制、浸润转移及治疗药物的反应对改善CRC患者预后至关重要。CRC小鼠模型为研究肿瘤发生发展、转移和抗肿瘤治疗的基本工具。将CRC小鼠模型分为自发性模型、诱发性模型、移植性模型、转基因模型。但是没有一个模型概括出整个结直肠癌发展的过程，根据特定的研究目的选择合适的CRC小鼠模型至关重要。本综述旨在介绍常用CRC小鼠模型方法，比较其优缺点，为CRC的研究提供参考。

1 自发性模型

自发性胃肠道肿瘤在小鼠中很少见。研究发现，9.5%的C57BL/6老年小鼠在胃肠道中具有肿瘤或增生性病变，小肠多是上皮腺腺瘤或腺癌，结肠中仅有两个上皮腺腺瘤[2]。自发性CRC小鼠代表了人类自然状态下发生CRC，但是发生时间极长且癌变率极低。

2 诱发性模型

2.1 饮食诱发性模型

流行病学表明富含脂肪食物和纤维含量低的食物可增加人类结直肠癌的风险[3]。Yang等[4]发现西式饮食(高脂肪、低钙和低维生素D3)喂食1.5年小鼠可诱导CRC的发生，且小鼠显示75%的APC+/-和57%的Muc2-/-突变。饮食诱发性小鼠模型代表了人类食物引起的CRC发生的基本复杂性，但不能评估哪些突变导致肿瘤的发展。

2.2 化学物诱导模型

2.2.1 DMH和AOM

化合物1,2-二甲基肼(DMH)和氧化偶氮甲烷(AOM)是两个最常用诱导散发性CRC小鼠模型的肿瘤诱导物。Marion等[5]用DMH连续给药10周，在20 ～ 24周发现60%的小鼠出现结直肠癌。在给药期间AOM比DMH具有更强的效力和更高的稳定性。Necfert等[6]用AOM重复腹腔注射小鼠30周，可诱导小鼠结直肠癌。DMH和AOM化学诱导肿瘤发病机制及肿瘤生长环境与人相似，方法相对简单，是研究中非常有用的模型。但是诱导周期较长，肿瘤转移率过低，不能用于结直肠癌转移模型的研究。

2.2.2 PhIP

2-氨基-1-甲基-6-苯基亚氨基[4,5-b]吡啶(PhIP)是烤鱼和烤肉时产生的杂环胺，是小鼠中引起结肠癌的诱变剂。Andreassen等[7]将3 ～ 4 d大的APCmin小鼠皮下注射50 mg/kg PhIP，11周后发现大肠内肿瘤和囊性隐窝的数量增加。Tanaka等[8]将CD-1小鼠单次给予200 mg/kg PhIP联合DSS喂水1周，16周后小鼠出现结肠肿瘤。PhIP常用于不同遗传背景的大鼠肠癌模型的研究。

3 移植性模型

3.1 皮下移植瘤模型

皮下移植瘤是指将人的结直肠癌细胞或患者结直肠肿瘤组织接种在免疫缺陷小鼠的皮下，使免疫缺陷小鼠皮下形成肿瘤组织。李井泉等[9]通过在裸鼠皮下注射LoVo细胞悬液，成功建立CRC皮下移植瘤模型，用于评价PLGA-5-氟尿嘧啶缓释微球的治疗效果。李小颖等[10]利用红色和绿色荧光蛋白标记HCT-116细胞建立光学CRC肿瘤模型，动态观察HCT-116肿瘤细胞在裸鼠皮下生长过程。Burgenske等[11]利用来自CRC患者手术切除的肿瘤组织皮下植入裸鼠，成功建立了CRC患者来源的异种移植(patient-derived tumor xenograft, PDX)模型，结果发现CRC PDX模型在细胞和遗传水平上都表现出异质性，并且组织学显示腺体形成的柱状上皮样结构和产生粘蛋白的细胞的存在的特性。皮下移植瘤模型操作简单和成瘤率高，方便实时监测肿瘤的生长情况和评估药物治疗效果，但是皮下移植瘤模型不是自然形成肿瘤，难以模拟人结直肠肿瘤原位生长的情况和肿瘤侵袭转移的特性。

3.2 原位移植瘤模型

原位移植模型弥补了皮下移植瘤模型难模拟结直肠肿瘤原位生长情况和侵袭转移特性。Hite等[12]利用荧光素酶标记的HT-29肿瘤细胞注射NOD/SCID小鼠直肠，建立了模拟CRC患者原发肿瘤生长和肝转移和肺转移模型。小鼠CRC肝转移和肺转移模型的方法有很多[13-14]，本文不作过多描述。原位移植可模拟人结直肠肿瘤发生发展和侵袭转移的过程，可获得CRC肿瘤组织细胞表面结构完整性和细胞间协同性，原位移植的成瘤率高。但是手术操作复杂，小鼠易死亡，不易观察肿瘤生长情况。

4 转基因模型

转基因技术是将外源基因导入宿主基因组，在染色体中稳定整合并遗传给下一代。转基因技术类型多样，但是应用较多和较稳定的是显微注射技术，该技术利用显微注射仪将外源基因通过显微注射入受精卵雄核获得转基因动物[15]。基因敲除结直肠癌模型就是将相关的抑癌基因等人为缺失掉，包括新型基因组修饰技术CRISPR/Cas9技术和Cre/loxp诱导的条件敲除体系法[16]。

4.1 结肠癌腺瘤性息肉模型

结肠癌腺瘤性息肉(adenomatous polyposis coli, APC)基因作为抑癌基因直接参与Wnt信号通路，影响细胞周期G1向S转变，APC突变导致肠道上皮细胞生长失调，导致肠道形成CRC[17]。80%散发性结直肠癌发生第一步可能是APC突变引起。APCMin/+转基因小鼠是研究肠道肿瘤发生、发展过程的经典模型。随后多种类型APC转基因小鼠模型被开发用于 CRC的研究[18]。条件性APC小鼠模型构建用于研究不同发育阶段肠道以外器官中的功能。Robanus等[19]构建一个条件缺失外显子15的APC15lox/+转基因小鼠模型，小鼠表现更长的生存期并导致结直肠发生和发展肿瘤，与人类家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis, FAP)的散发性结直肠癌相似。Takaku等[20]将Smad4突变引入APCΔ716小鼠导致局部侵袭性恶性腺癌而无转移。与APCMin小鼠相比，BubR1+/-和APCMin小鼠导致结肠肿瘤数量增加10倍[21]。

4.2 遗传性非息肉模型

遗传性非息肉性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC)患者在结肠和直肠中发生较早，一般多由MMR基因突变，如Mlh1、Msh2和Msh6。纯合Mlh1、Msh2和Msh6敲除小鼠表现包括胃肠道在内的多个器官中发生肿瘤，但是小鼠过早死于侵袭性淋巴瘤，这与具有双等位基因错配修复突变的患者非常相似[22-23]。与HNPCC患者的肿瘤相似，Msh2-/-小鼠的肿瘤具有较高的微卫星不稳定(microsatellite in stability, MSI)[22]。

4.3 其他模型

KrasV12G/APC+/1638 N转基因小鼠模型的肠道肿瘤增殖更快，并且凋亡水平降低[24]。Pten和Pik3ca基因突变小鼠与Apc基因突变小鼠杂交，加速小鼠形成肠腺癌[25]。当Pik3ca在肠内单独表达时，小鼠会发展为浸润性粘液肠道腺癌[26]。APCMin/+Tp53-/-双基因突变或删除的C57BL6/J背景的小鼠表现更高肿瘤负荷和侵袭性肿瘤发展[27]。Paul等[28]开发了由Car1基因驱动的可诱导盲肠和近端结肠特异性Car1CreER敲入小鼠模型，从而可对Cre活动进行时时控制。

5 结论与展望

结直肠癌小鼠模型在结直肠癌发病原因、机制和治疗研究中起着关键作用。目前四种不同的CRC小鼠模型，每种模型只能部分地模拟人结直肠癌特征，这些模型可能预测治疗临床疗效的能力有限。因此，要根据特定的实验目的，选择相对较优的模型(表1)。自发和食物诱导的模型常用于研究对CRC形成的治疗或预防作用。化学诱导的小鼠模型模拟人类散发性结直肠癌，并且常用于研究饮食对癌变的影响。原位接种的CRC小鼠模型概括了CRC原位发生及转移的一些特征，多用于抗肿瘤及转移药物评估。基因工程小鼠模型可用于研究特定基因组改变在结直肠癌的发生和发展的重要性及其对各种治疗的敏感性。常用的化学诱导和遗传小鼠模型无法再现人类疾病的复杂性，移植性人结肠癌细胞于小鼠可能受到长期培养的细胞系，不再反映新鲜分离的肿瘤的特征细胞。根据各种模型的优缺点，结合实验目的选择合适小鼠模型。期待通过发展新技术和方法建立更好的CRC小鼠模型，以更好地指导CRC分子机制和药物治疗研究。