介质特性对超声波钝化芒果多酚氧化酶和过氧化物酶的影响

2020-05-01周亨乐邢亚阁刘晓翠毕秀芳

中国食品学报 2020年4期

刘洪周亨乐陈磊，2 邢亚阁刘晓翠毕秀芳*

（1 西华大学食品与生物工程学院四川省食品生物技术省高校重点实验室成都610039 2 宜宾西华大学研究院四川宜宾 644000）

超声波是一种极具发展前途的非热杀菌技术，其中频率在20～100 kHz，功率密度为10～1 000 W/cm2的高场强超声波，在食品加工中最为常用[1]。近年来，超声波作为非热加工技术在食品工业中的应用得到越来越多学者的关注[1]。目前，超声技术被应用于多种果蔬汁加工中。超声波处理果蔬汁不仅能达到较好的杀菌效果，而且还能有效钝化酶的活性[2]。超声波对酶的钝化作用主要是因其引起的空化效应，形成空化气泡，并在气泡破裂时产生极高的温度和压力，释放出大量的能量，而导致酶分子的空间构象发生改变[3]。

芒果是著名的热带水果，其果肉细腻、风味独特、品种繁多、种植地域广，又被称为“热带水果之王”[4]。成熟的芒果果实中糖分和蛋白质含量分别约为12%和0.6%，还含有丰富的果胶，pH 值为3.40～4.80[5]。目前，芒果除鲜食外，大部分被加工成芒果汁、芒果原浆和芒果罐头等。芒果中多酚物质含量丰富，在加工过程中极易受到机械损伤，导致其亚细胞结构被破坏，使类囊体中释放的多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）与液泡中释放的酚类物质接触，从而发生褐变反应，影响其外观风味及营养物质[6]。除PPO 外，引起芒果褐变的酶主要还有过氧化物酶（Peroxidase，POD）[7]。前人研究发现超声波处理对PPO 和POD 有显著钝化效果[8-9]。

超声波对食品内源酶的钝化效果主要受超声波作用参数、环境条件和介质特性等影响。前人的研究主要集中于超声波钝酶处理参数（功率、时间、温度、间歇比等）的优化[10]，而关于环境条件及介质特性对钝酶效果的影响研究较少。其中，介质中碳水化合物、蛋白质等组分的含量可能是影响超声波钝酶效果的重要因素。一般而言，由于食品中其它成分的存在对酶具有保护作用，所以导致单一缓冲溶液中的酶比在实际食品体系中更容易钝化。Lopez 等[11]研究发现在介质中添加抗坏血酸、糖等成分能提高脂肪氧合酶（LOX）的稳定性，从而降低超声波的钝化效果，而加入氯化钾对超声波钝酶效果影响不大。本文通过研究超声波对不同糖含量、蛋白质添加量，pH 值及介质黏度的芒果粗酶液的钝化效果，为芒果汁钝酶加工提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料：攀枝花地区主栽的凯特芒果，产于攀枝花市盐边县。选取无机械伤，无病虫害，成熟度适中、果重均匀的芒果。

白砂糖，上海信冉食品有限公司；柠檬酸，郑州润杰化工产品有限公司；大豆蛋白胨，北京鸿润宝顺科技有限公司；卡拉胶，腾州市香凌生物工程有限责任公司；黄原胶，山东优雪化工科技有限公司；阿拉伯胶、羧甲基纤维素钠（CMC-Na），浙江多味化工食品有限公司；商品苹果果胶、柑桔皮果胶、邻苯二酚、交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；过氧化氢（30%），天津市致远化学试剂有限公司；愈创木酚，国药集团化学试剂有限公司；其余试剂均为分析纯级，成都科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

SCIENTZ-IID 超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；WFJ7200 分光光度计，尤尼柯仪器有限公司；MC-00000411pH 计，成都世纪方舟科技有限公司；糖度计，广州市爱宕科学仪器有限公司；MCR302 流变仪，奥地利安东帕公司；Heraeus multifuge X1R 台式高速大容量冷冻离心机，赛默飞世尔科技公司；GL124-1SCN 电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；MJBL25B26 多功能家用搅拌机，美的集团；HH-6 水浴锅，金坛市医疗仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 芒果汁的制备将新鲜芒果切成小块，加入3 倍质量水，打浆，4 层纱布过滤2 次，制得芒果汁。芒果汁经测定其糖度为5.5 Birx，pH 值为5.7，黏度为25.7 mPa·s。

1.3.2 粗酶液的制备将新鲜芒果去皮去核后倒入食物搅拌机，以1∶3（g/mL）的比例加入0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH 6.50）打成匀浆，4 层纱布过滤2次，加入4%的PVPP 后静置聚沉12 h。聚沉液在4 ℃，8 000 r/min 条件下离心25 min，上清液即为粗酶液。粗酶液经测定其糖度为4.4 Brix，pH 值为5.2，黏度为15.2 mPa·s。

1.3.3 粗酶液介质特性的调整介质糖含量调整，添加蔗糖至糖度分别为5，10，15，20 Brix；介质蛋白质含量调整，分别添加0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的大豆蛋白胨；介质pH 调整，加入柠檬酸，至pH 分别为3，4，5；介质黏度调整，通过分别向粗酶液加入卡拉胶、苹果果胶、柑桔皮果胶、CMC-Na、黄原胶、阿拉伯胶等6 种增稠剂，至黏度为17.6，19.4，22.7，25.4，27.1 mPa·s。

1.3.3 酶活性的测定粗酶液酶活测定：PPO 活性的测定参照Tan 等[2]的方法，并略加修改。向试管中加入3 mL 0.1 mol/L 的邻苯二酚溶液，并于30°C 保温3 min，然后加入0.4 mL 粗酶液，迅速摇匀后，倒入比色皿中，于420 nm 波长下测定吸光值，每10 s 记录1 次吸光值，连续记录60 s。以向底物中添加0.4 mL 磷酸缓冲液为吸光值空白调零。

POD 活性的测定参照文献[12]的方法。向试管中加入3 mL 1.0%愈创木酚和0.2 mL 1.5%过氧化氢于30°C 保温3 min，加入0.2 mL 粗酶液，迅速摇匀后，倒入比色皿中，于470 nm 波长下测定吸光值，每20 s 记录1 次吸光度值，连续记录100 s。以向底物中添加0.2 mL 磷酸缓冲液为吸光值空白调零。

芒果汁酶活测定：芒果汁中加入4%的PVPP，并于4°C，8 000 r/min 条件下离心25 min，上清液即为酶液，按照上述步骤测定。

PPO 和POD 的一个酶活力单位（U）定义为每分钟吸光值增加0.1。并利用公式（1）计算残余酶活力：

式中，At——处理后样品酶活力；A0——未处理样品初始酶活力。

1.3.4 超声波处理取30 mL 粗酶液或芒果汁于50 mL 烧杯中进行超声处理，超声波处理时水浴温度为45°C，超声波功率密度为799.31 W/cm2，脉冲间隔为2 s 开2 s 关，探头浸入液面深度为1.5 cm，超声波处理时间为15 min。

1.3.5 数据统计分析数据采用方差分析（ANOVA），使用软件Origin8.5（美国Microcal 公司）进行统计并绘图。α=0.05，所有试验重复2 次。

2 结果与分析

2.1 超声波对粗酶液和芒果汁钝酶效果的比较

在45°C，799.31 W/cm2，15 min 条件下，超声处理对粗酶液和芒果汁中PPO 和POD 的钝化效果如图1 所示。超声波使粗酶液和芒果汁中PPO活性分别下降了40.31%，15.87%，POD 活性分别下降了64.50%，21.82%。结果表明，超声波对芒果汁中PPO 和POD 的钝化效果显著低于对粗酶液的钝化效果。这种差异可能是由于粗酶液和芒果汁的保护性组分含量和介质黏度不同所致。相关研究表明，处理介质特性的差异会影响超声波空化效应传递效果，从而影响超声波钝酶效果[13]。

图1 超声波处理对芒果汁和粗酶液中PPO和POD 的钝化效果Fig.1 Inactivation effect of ultrasound on PPO and POD activity in mango juice and crude enzyme solution

2.2 不同组分对超声波钝酶效果的影响

2.2.1 糖含量对超声波钝酶效果的影响在45℃，799.31 W/cm2，15 min 条件下，超声波处理对不同糖含量的粗酶液中PPO 和POD 的钝化效果如图2 所示。不同糖含量对未处理粗酶液酶活性无显著性影响（P＞0.05）。将粗酶液糖含量从4.4 Brix提高至5 Brix 和10 Brix，经超声波处理后，随着糖含量的升高，PPO 和POD 的超声波钝化率显著降低（P＜0.05）。与未调整组相比，糖含量为5 Brix和10 Brix 的粗酶液中PPO 超声波钝化率分别降低了20.67%和29.36%，POD 超声波钝化率分别降低了40.34%和46.22%。继续提高粗酶液中的糖含量至15 Brix 和20 Brix，PPO 和POD 的超声波钝化率未进一步降低（P＞0.05）。结果表明在一定范围内，随着糖含量的提升，体系对超声波钝化中PPO 和POD 的保护效果随之提升。Lopez 等[11]发现通过向LOX 酶液中添加一定量的蔗糖或葡萄糖（2.9%～10.9%）可以降低压热超声（MTS，20 kHz，71 ℃，10 min）对LOX 的钝酶效果，两种糖都能提高LOX 对MTS 的耐受性。Vercet 等[14]通过向橙汁体系和柠檬酸盐缓冲液中添加糖分（3%葡萄糖、3%果糖、6%蔗糖），发现这些糖分可以使果胶甲酯酶（PME）在MTS（24 kHz，72～82 ℃，5 min）下的D 值增加3 倍，显著增强了PME 的MTS 稳定性。这可能是由于添加糖分增加了酶蛋白质的稳定性，从而不易被超声波破坏[14]。

图2 超声波处理对不同糖含量粗酶液中PPO 和POD 的钝化效果Fig.2 Inactivation effect of ultrasound on PPO and POD activity in crude enzyme solution with different sugar content

2.2.2 蛋白添加量对超声波钝酶效果的影响在45°C，799.31 W/cm2，15 min 条件下，超声波处理对不同蛋白添加量的粗酶液中PPO 和POD 的钝化效果如图3 所示。不同蛋白添加量对未处理粗酶液酶活性无显著影响（P＞0.05）。向粗酶液中添加0.5%和1.0%的蛋白，经超声波处理后，随着蛋白添加量的增加，PPO 和POD 的超声波钝化率发生显著性降低（P＜0.05）。与未调整组相比，0.5%和1.0%的蛋白添加量粗酶液中PPO 和POD 钝化率分别降低了24.55%，42.36%和30.9%，47.19%。继续提高粗酶液中的蛋白添加量至1.5%，2.0%和2.5%，PPO 和POD 的超声波钝化率未进一步降低（P＞0.05）。结果表明一定量范围内，蛋白添加可以抑制超声波的钝酶效果，且该抑制效果与蛋白添加量呈正相关。Tarun 等[15]发现添加大豆蛋白（1%，2%）使超声波（1.0 W/cm2）对脲酶的钝化率降低18%。蛋白质可以降低超声波对葡萄球菌[16]、大肠杆菌[17]的杀灭效果，可能是由于蛋白质可以影响超声波的传递，从而减少其空化作用，影响超声波的杀菌效果[17]。本试验中蛋白质抑制超声波钝酶效果也可能是因为超声波空化作用受到限制，减少了能量的释放，从而使得超声钝酶效果降低。

图3 超声波处理对不同蛋白添加量的粗酶液中PPO 和POD 的钝化效果Fig.3 Inactivation effect of ultrasound on PPO and POD activity in crude enzyme solution with different protein addition

2.2.3 pH 对超声波钝酶效果的影响在45°C，799.31 W/cm2，15 min 条件下，超声波处理对不同pH 的粗酶液中PPO 和POD 的钝化效果如图4 所示。在4.0～5.2 范围内，pH 对未处理粗酶液酶活性无显著影响（P＞0.05），经超声波处理后，pH 4.0 和pH 5.0 的粗酶液中PPO 和POD 钝化率与未调整组相比分别降低了22.73%，27.19%和41.32%，34.58%。继续降低粗酶液pH 值至3.0，未处理的PPO 和POD 活性显著降低（P＜0.05），比未调整组粗酶液的活性分别降低了21.57%和13.69%；经超声波处理后，与pH 值为4.0 的粗酶液相比，PPO 和POD 的超声波钝化率未发生显著变化。结果表明在一定范围内，降低pH 值可以抑制超声波的钝酶效果，pH 3.0 的酸性环境可直接抑制PPO 和POD 的活性。相反的结果被前人所报道，Thakur 等[18]研究了超声波（200 W，10 min）对不同pH 值的大豆粉悬浮液中LOX 活性的影响，发现当pH＞5 时，超声波对LOX 的活性影响较小，而pH 值在4.0～5.0 时，相同的超声波条件可使LOX活性降低70%～85%。Lopez 等[11]也发现随着pH 值的升高，LOX 的MTS（2.64 MHz，67.5～76.3 ℃，10 min）稳定性提高。不同结果可能是由于酶的种类、来源以及最适反应pH 值不同所致。PPO 和POD分别是含铜和铁的酶蛋白，其活性与pH 值密切相关，当其处于高酸性环境中，蛋白质可能发生变性从而导致酶活性降低，这可能是本研究中pH 3.0的未处理粗酶液中PPO 和POD 活性降低的原因。超声波处理时，当PPO 和POD 接近其最适反应pH 值（6.5）时，其活性部位的酸性或碱性氨基酸侧链基团发生解离，影响酶的活化和酶与底物的亲和力，从而更易被超声波钝化[19]，这可能是本研究中pH 值越高，超声波钝酶效果越好的原因。

图4 超声波处理对不同pH 粗酶液中PPO 和POD 的钝化效果Fig.4 Inactivation effect of ultrasound on PPO and POD activity in crude enzyme solution with different pH

2.3 同介质黏度对超声波钝酶效果的影响

在45°C，799.31 W/cm2，处理15 min 条件下，超声波对不同黏度粗酶液中PPO 和POD 的钝化效果如图5 所示。本研究范围内，黏度的改变对未处理粗酶液酶活性无显著影响（数据未显示，P＞0.05）。随着黏度增加，PPO 和POD 超声波钝化率发生显著性降低（P＜0.05），与未调整组（黏度15.2 mPa·s）相比，使用卡拉胶增稠后，黏度为27.1 mPa·s 粗酶液中PPO 和POD 钝化率分别降低了27.14%和29.96%。6 种增稠剂在相同黏度下的超声钝酶效果差异不显著（P＞0.05）。结果表明，增加介质黏度可以抑制超声波的钝酶效果，不同增稠剂增稠作用对超声波钝酶效果影响不大。吴虹等[20]发现使用超声波（100 W）进行脂肪酶催化转酯反应时，处于高黏度反应液中的酶活力仅为81%，显著低于低黏度组。Raviyan 等[21]发现超声波（25 kHz，55 ℃）对缓冲液中PME 的钝化效果要显著高于对番茄汁体系中PME 的钝化效果。Vercet等[14]发现橙汁体系的PME 超声波抗性是其在柠檬酸盐缓冲液的25 倍，这可能是由于果胶的存在。介质会影响超声波的传递和能量分布，高黏度的介质使声波传递困难，导致能量分布不均、消耗大。果汁匀浆的黏度一般高于缓冲液的黏度，高黏度的果汁超声产生的空化数量少，可能降低超声波的钝酶效果[13]。