脉冲强光对黄曲霉菌孢子的杀菌效果、微观结构及动力学的影响

王 蓓 洪 晨 Ragab Khir 潘忠礼* 马海乐 周存山

（1 江苏大学食品与生物工程学院 江苏镇江 212013 2 加利福尼亚大学戴维斯分校生物与农业工程系 美国戴维斯 95616）

黄曲霉菌（Aspergillus flavus）是一类土壤腐生真菌，菌体由许多复杂的分枝菌丝构成，气生菌丝形成分生孢子梗，小梗上着生球形分生孢子[1]，成熟的孢子会随气流附着在食品表面。孢子在食品储藏过程中萌发生长，产生剧毒的次级代谢产物黄曲霉毒素（aflatoxin），而真菌本身也会导致动物和免疫功能低下人群曲霉病发病率的增加[2]。由于黄曲霉菌孢子潜在危害大，繁殖能力极强，易散播，对食品安全及人类健康存在很大的威胁，因此，需要对其进行有效的杀菌。目前常用的杀菌方式主要是热力杀菌、化学杀菌和辐照杀菌等[3-5]。这些方法在对食品风味质量、残留、消费者可接受程度等方面存在不足，亟需一种高效、安全、环保的杀菌技术。

脉冲强光（Pulsed light）是一种新兴的非热杀菌方式，具有高效、节能、环保、安全等特点。脉冲强光技术是利用瞬间放电以脉冲的形式激发灯管中的惰性气体，发出强烈的白光，其产生的光热和光化效应能破坏微生物的细胞壁和DNA 结构，从而杀灭微生物[2]。

微生物致死动力学模型可以定量评价和预测杀菌效果，对实际应用具有指导意义。在传统热力学杀菌中，常应用一级动力学方程[6]，采用D 值或Z 值来确定杀菌工艺[6-8]。热力学杀菌的机理是使蛋白质变性，酶钝化或失活，而酶钝化的过程符合一级动力学方程。传统紫外杀菌是通过破坏DNA使菌代谢紊乱、失活，其中紫外杀菌模型常采用Log-linear 模型[9-10]。而脉冲强光与热力学杀菌和紫外杀菌机理不同，它是通过光热和光化的协同作用杀灭微生物，因此，需要建立新的杀菌动力学模型以描述其杀菌特征。研究发现脉冲强光杀菌动力学曲线更加符合非线性模型[11-14]。在脉冲强光杀菌过程中，根据杀菌对象不同，模型也有所不同。张瑞雪等[15]研究脉冲强光对副溶血性弧菌的动力学模型，发现Weibull 模型和Log-logistic 模型较Linear 模型能更好地模拟杀菌动力学。Izquier 等[16]对蔬菜上自然产生的细菌进行脉冲强光杀菌，发现生菜、卷心菜和胡萝卜适合采用Weibull 模型，同时生菜也适合Weibull+tail 模型。本试验以黄曲霉菌孢子为受试菌株，研究脉冲强光强度和处理时间对固体培养基中黄曲霉菌孢子的杀菌效果，并对处理前、后孢子的微观形态进行扫描电镜分析。运用Log-linear 模型、Weibull 模型和Weibull+tail 模型对杀菌致死曲线进行动力学分析，以期为食品及农产品中黄曲霉杀灭的基础与应用研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

黄曲霉菌株（Aspergillus flavus）NRRL-3357，美国农业部西部研究中心；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA 培养基），美国Sigma-Aldrich 公司；巴特菲尔德磷酸缓冲溶液（Butterfield's phosphate buffer）及其余试剂（均为分析纯级），美国Sigma-Aldrich 公司。

1.2 仪器与设备

SteriPule-XL®3000 实验室规模脉冲强光杀菌系统，美国Xenon 公司，具体设备参数见文献[17]；NU-425-600 型超净工作台，美国NuAire股份有限公司；FFU20F3AWA 型恒温培养箱，美国Scientific Division，Jouan 股份有限公司；SR-24C 型高压灭菌锅，美国Consolidated Stills &Sterilizers 公司；K-550-G 型漩涡振荡仪，美国Scientific Industries 股份有限公司；S-4700 扫描电子显微镜（SEM），美国Hitachi High-Technologies 股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黄曲霉菌孢子悬液的制备 取活化后的黄曲霉菌斜面试管，用无菌接种环小心的刮取表面形成的孢子，转入装有10 mL 缓冲溶液的锥形瓶中，重复上述步骤，制成孢子悬液。将锥形瓶置于漩涡振荡器上，振荡1 min 后获得分散的菌丝-孢子悬液。用3 层无菌纱布过滤此悬液得到孢子悬液，将孢子悬液的浓度调整到105CFU/mL。

将0.1 mL 黄曲霉菌孢子悬液均匀涂布于直径为60 mm 的无菌PDA 平板上，盖上盖子并放置于无菌环境中20 min，待表面水分蒸发备用。

1.3.2 脉冲强光杀菌 将涂布好黄曲霉菌孢子的平板放置于脉冲强光杀菌室灯管正下方，移去培养皿盖。设定样品与石英窗之间的距离分别为5，9，13，17 cm，处理不同时间（1～60 s）做3 组平行试验。石英窗与灯管的距离为5.8 cm，上述距离对应的脉冲强光的强度分别为2.86，1.60，1.08，0.93 W/cm2。处理后的培养皿放置于30 ℃培养箱培养3 d 后进行菌落计数。

1.3.3 菌落计数 按照国标GB 4789.2-2016[18]对处理前、后黄曲霉菌孢子进行菌落计数。

1.3.4 扫描电镜分析 将黄曲霉菌孢子悬液分成未处理组和脉冲强光处理组，未处理组：直接吸取0.25 mL 未处理孢子悬液注入固定液中；脉冲强光处理组：将0.25 mL 孢子悬液在强度为1.08 W/cm2的脉冲强光下处理10 s 后收集注入固定液中。参照文献[19]的方法进行电镜检测。将固定好的样品用台式离心机离心2 min 以浓缩孢子。浓缩的孢子用pH 7.2 的0.1 mol/L 二甲胂酸钠缓冲液重新使孢子悬浮，并冲洗3 次，每次离心1 min 然后固定于1%四氧化锇溶液中。孢子用水重新悬浮并冲洗3 次，每次离心1 min。孢子重新悬浮于水中，并使用0.1 μm 孔径的核孔径迹蚀刻膜过滤器过滤。膜过滤器预先用聚-L-赖氨酸处理以提高孢子对膜的附着力。将膜置于13 mm 膜固定器上，并连接到3 mL 一次性Luer-Lock 头注射器上。带有样品的膜在空气干燥（23 ℃）后用双层粘图层碳标签安装在铝样品蒂上，并在Desk II 喷溅包衣单元用金-钯包衣90 s。孢子在2 kV 发射场扫描电子显微镜下观察和拍照，照片在2 560×1 920 dpi 分辨率下拍摄。

1.3.5 脉冲强光技术的杀菌动力学模型 紫外和脉冲强光杀菌动力学选用3 个经典数学模型：Log-linear 模型、Weibull 模型和Weibull+tail 模型。使用Geeraerd 等[20]发布的统计学软件GInaFIT来计算模型参数。

1）照射能量 照射能量是在某一照射强度下处理一定时间，物体所受到的脉冲强光照射的能量。照射能量F 与照射强度I 和处理时间t 之间的关系为：

式中，I——照射强度，W/cm2；t——照射处理时间，s。

2）Log-linear 模型 该模型假设微生物具有相同的抗逆性，致死动力学可以用线性模型来描述，微生物下降的对数值随时间的变化呈线性变化，即：

式中，N——孢子存活量，CFU/g；N0——初始菌数，CFU/g；F——照射能量，J/cm2；kmax——失活速率，cm2/J。kmax经典单位为1/min，表示的是1 min 能够降低的lg 数。在本文中，它代表1 J/cm2能量能够降低的lg 数。

3）Weibull 模型 Weibull 方程属于分布函数。该模型假设菌体间的热逆性有差别且符合Weibull 分布。其数学模型为：

式中，N——孢子存活量，CFU/g；N0——初始菌数，CFU/g；F——照射能量，J/cm2；δ——降低微生物一个对数所需的照射能量，J/cm2；p——形状参数（无量纲），当p＞1 时，曲线呈单调下凹，当p＜1 时，曲线呈单调上凹，当p=1 时，曲线为一条直线，此时Weibull 模型变为：

此形式的Weibull 模型与一级动力学方程一致，δ=1/D，D=ln10/k，一级动力学方程可看作Weibull 模型的特定形式[21]。

4）Weibull+tail 模型 考虑到实际生产中存在一类抗逆性较强，不易杀死的稳定孢子，即使延长杀菌时间也不能降低，因而形成拖尾的特点，采用Albert 和Mafart[22]提出的模型：

式中，N——孢子存活量，CFU/g；N0——初始菌数，CFU/g；Nres——抗逆稳定孢子，CFU/g；F——照射能量，J/cm2；δ——降低微生物一个对数值所需的照射能量，J/cm2；p——形状参数（无量纲）。

5）模型拟合度的验证评价 采用SPSS 19.0对试验数据分别进行Log-linear 模型、Weibull 模型和Weibull+tail 模型的拟合处理，得到脉冲强光杀菌的动力学方程，以均方根误差RMSE、决定系数R2、精确因子Af和偏差因子Bf这4 个参数来评判拟合度的优劣。RMSE、Af和Bf的计算公式如下：

式中，α——预测值；β——实测值；m——试验值个数。

Af反映了预测值与实际值偏离的程度，Af值越小表明模型的预测值与实际值越接近，模型越精确。当Bf＞1 表示模型的预测值比实际值高，当Bf＜1 表示模型预测值比实际值低，Bf越接近1，模型拟合度越高。决定系数R2和RMSE 表示模型的精确度、可靠度，R2越接近于1，RMSE 越小，模型拟合度越高。

2 结果与分析

2.1 脉冲强光杀菌效果

图1 脉冲强光在不同时间和强度下对黄曲霉菌孢子的杀菌效果Fig.1 Inactivation effect of Aspergillus flavus spores under different times and intensities of pulsed light treatments

由图1 可知，脉冲强光能够快速有效的使黄曲霉菌孢子失活，杀菌效果与处理时间存在显著性关系（P＜0.05）。在强度为2.86 W/cm2照射下，处理1 s 即可降低（2.08±0.30）lg（CFU/mL），随着时间的延长，杀菌效果显著提高，18 s 后可降低（4.79±0.1）lg（CFU/mL），19 s 后黄曲霉菌孢子被全部杀死。杀菌效果与照射强度间也存在显著性关系（P＜0.05）。在照射强度0.93，1.08，1.60，2.86 W/cm2条件下同样处理1 s 后，杀菌效果分别为（0.64±0.32），（1.04±0.20），（1.33±0.28），（2.08±0.30）lg（CFU/mL）。照射能量是杀菌时间和照射强度共同作用的结果，因此，采用照射能量作为动力学研究的变量。

2.2 扫描电镜分析

图2 显示的是脉冲强光处理前、后黄曲霉菌孢子的扫描电镜照片，通过对处理前、后孢子形态结构特征的观察可以看出，未处理的孢子形态完整，呈球形，表面有突起。脉冲强光处理后的孢子体积变小且不规则，表面皱缩，并出现孔状结构。

黄曲霉菌孢子的细胞壁主要成分是几丁质其次是纤维素等，因此具有支撑和保护细胞内部的作用。脉冲强光处理使孢子崩溃可能是由于细胞质从细胞壁的孔状结构泄露导致。目前已经有充分的研究表明，脉冲强光对微生物的致死是光化学和光热效应共同作用的结果[23-24]。光化学效应能够导致靶细胞DNA 链的断裂，光热效应主要导致细胞壁的破坏。在脉冲强光处理过程中，高能照射导致瞬间温度升高，胞内水分快速蒸发形成微小的蒸汽，从而导致细胞膜膨胀破裂，细胞质泄露[25-26]。可以肯定的是，脉冲强光对黄曲霉菌孢子的杀菌是通过对细胞壁的破坏，对于是否破坏DNA 有待进一步研究。

图2 黄曲霉菌孢子的扫描电镜显微照片（照射能量：5.2 J/cm2）Fig.2 SEM picture of Aspergillus flavus spores（fluence：5.2 J/cm2）

2.3 脉冲强光杀菌动力学

1）模型的选择和参数的确定 将结果中的照射能量与杀菌效果通过SPSS 回归拟合，分别得到了线性模型、Weibull 模型和Weibull+tail 模型的参数（表1），通过对比R2可以直观看出线性模型拟合度较差。通过比较Weibull 和Weibull+tail两个模型的RMSE 和R2发现在5，9 cm 和17 cm数据中Weibull+tail 模型拟合度较高，而在13 cm这组数据中Weibull 模型拟合度较高；通过比较Af和Bf反映出在9 cm 这组数据中Weibull+tail模型拟合度较高，而在5，13 cm 和17 cm 数据中Weibull 模型拟合度较高，在两个模型都比较接近实际值时难以直接判断哪个模型拟合度更高。因此，为了进一步评判这3 个模型的精确度，将预测值与实际值进行相关性分析，比较相关系数的大小。

表1 脉冲强光处理琼脂表面黄曲霉菌孢子失活的3 个模型的动力学参数Table 1 Kinetics parameters of three models for inactivation by pulsed light of A.flavus spores on agar surface

3 个模型进行预测值与实际相关性分析结果显示，线性模型、Weibull 模型和Weibull+tail 模型的相关系数分别为R2=0.7893、R2=9537 和R2=0.9727，P＜0.0001，试验个数n=74。可以看出，Weibull+tail 模型的相关性更高（图3）。

因此确定Weibull+tail 模型为脉冲强光杀灭黄曲霉菌孢子的模型。将拟合得到的参数带入Weibull+tail 模型可以得到黄曲霉菌孢子存活量与照射能量之间的关系式，当样品与石英窗距离为5 cm 时：

距离为9 cm 的关系式为：

距离为13 cm 的关系式为：

距离为17 cm 的关系式为：

2）脉冲强光杀菌曲线的特征分析 图4 显示的是不同强度下黄曲霉菌孢子Weibull+tail 模型的致死拟合曲线，可以看出曲线的特点为：曲线初始没有肩型，中段呈上凹形态，虽有拖尾但较短。没有肩型的特点是有利于灭菌的，因为菌株数量减少速度较快。一般没有肩型有两种可能，一种是确实没有肩型，另一种是有肩型而选择的照射能量值不密集从而没有显示[16]。本试验整个处理过程中，试验点的选择比较平均且密集，因此排除了埋没初始阶段肩型的可能。且初始较低的照射能量为0.92～2.08 J/cm2，对比其它研究显示出肩的照射能量如Bialka 等[27]为5.4 J/cm2，可以认为，本试验中的孢子致死拟合曲线确实没有肩。

δ 是决定降低1 个lg（CFU/mL）微生物所需的照射能量，5，9，13，17 cm 的δ 值分别为0.36，0.68，1.73，3.40 J/cm2，即随着距离的增加，降低1 lg（CFU/mL）黄曲霉菌孢子所需的照射能量逐渐增加，说明距离越近照射能量利用率越高。lgNres表示无法被杀死的微生物的数量，在本试验中由于采用的是光滑琼脂表面，所以当采用脉冲强光进行表面杀菌时孢子几乎完全失活，4 组lgNres值均接近于0。然而，如果载体为液体，如水、果汁、牛奶、食用油等lgNres会增加，这取决于脉冲强光的穿透力以及液体的浊度。而如果载体为表现相对粗糙的固体食品，如粮食、蔬菜、水果等，lgNres会更高，因为藏匿于缝隙或孔洞中的微生物不易被这种表面杀菌技术所杀灭。

图3 脉冲强光杀灭黄曲霉菌孢子效果的3 个模型预测值和实际值的相关性Fig.3 Correlation between calculated and tested values of survival ratios for inactivation by pulsed light of A.flavus spores on agar surface

图4 在不同距离条件下黄曲霉菌孢子Weibull+tail模型的致死拟合曲线Fig.4 Survival curves of A.flavus spores at different distances fitted with Weibull+tail model

3 结论

脉冲强光对固体培养基上黄曲霉菌孢子杀灭效果明显。杀菌效果与处理时间和脉冲强光的强度存在显著性关系（P＜0.05），随着时间的延长和强度的增大，脉冲强光对黄曲霉菌孢子的杀菌效果显著提高。在强度2.86 W/cm2条件下处理1 s可使孢子降低（2.08±0.30）lg（CFU/mL），18 s 后可降低（4.79±0.1）lg（CFU/mL），19 s 后可全部杀死。在照射强度0.93，1.08，1.60，2.86 W/cm2条件下同样处理1 s 后，杀菌效果分别为（0.64±0.32），（1.04±0.20），（1.33±0.28），（2.08±0.30）lg（CFU/mL）。

根据扫描电镜分析，脉冲强光能够利用其高能的光热作用破坏孢子细胞壁结构，导致黄曲霉菌孢子菌体胞浆物质外渗，阻碍其代谢而致死。

通过对杀菌效果和照射能量之间关系的研究，得到脉冲强光杀菌动力学特征与Weibull+tail模型和Weibull 模型拟合度高（决定系数R2＞0.95），经过进一步模型拟合度评价得出Weibull+tail 模型的相关性更高（R2=0.9727），并根据动力学参数得出黄曲霉菌孢子存活量与照射能量之间的关系式。形状参数δ 随着强度的减小而增加，说明距离越近照射能量利用率越高。