低剂量硝酸钙联合低氧曝气对黑臭底泥的修复探究

李卫平，张少康,，李晓光，王 凡，李国文，郝 禹，张列宇,*

1.内蒙古科技大学能源与环境学院，内蒙古 包头 014010 2.中国环境科学研究院，国家环境保护地下水污染过程模拟与控制重点实验室，北京 100012 3.中国环境科学研究院流域水环境污染综合治理研究中心，北京 100012

底泥是水体生态系统的重要组成部分，是水体中氮磷营养物主要储存库[1].底泥有机质和营养盐在厌氧条件下被SRB (硫酸盐还原菌)发酵并分解，产生CH4、H2S、CH4S、FeS和MnS等恶臭气体及黑色物质,造成水体变臭发黑[2-3].近年来，底泥污染物对上覆水的释放累积导致水体污染现象屡见不鲜[4].因此，底泥污染的内源治理是防治黑臭水体“反弹”的关键[5].

消除底泥黑臭主要有清淤疏浚和原位修复两类方法.通常清淤疏浚工程庞杂，不利于底泥的快速处理和二次利用[6].其中，以硝酸钙为修复剂的底泥原位处理技术得到广泛关注[7-9]，其修复机理为缺氧条件下，硝酸钙为底泥微生物提供电子受体，促进脱氮菌群快速繁殖，抑制SRB生长并降低AVS(酸挥发性硫化物)的生成和释放，该技术成本低廉且快捷有效.TANG等[7]利用硝酸钙和好氧反硝化菌来控制底泥中的氮素，修复115 d时TN含量减少了16.5%，可转移态氮含量从0.097 mg/g增至0.109 mg/g.刘树娟等[10]以硝酸钙为修复剂处理深圳河底泥，其中92%的AVS被去除.但当硝酸钙投加量过高(硝酸钙用量占底泥质量比例为2.5%～6.0%)时，将导致底泥硝酸盐含量的急剧升高，对底栖动物和水体动植物造成巨大危害[2,11].减少硝酸钙用量可在一定程度上消除硝酸盐激增引发的生态风险，并降低投药成本，但硝酸钙修复剂仍有可能在厌氧条件下发生DNRA(异化还原成铵)过程，并进一步对水体产生危害[12].研究[13-14]表明，低氧曝气技术可有效提升并改善水体DO及ORP条件，促进底泥微生物脱氮并防止硝酸盐的DNRA过程，这对于恢复泥水体系自净功能至关重要，而针对提升低氧曝气条件下硝酸钙对黑臭水体修复效果的研究仍鲜见报道.

基于此，该研究将低剂量硝酸钙作为修复剂联合水体低氧曝气技术，探讨不同修复条件下对底泥-上覆水体系中DO、ORP、TN、NH3-N、NO3--N、TOC(总有机碳)及AVS等指标含量的影响，确定最佳反应参数.结合高通量测序技术，探究该技术方法在底泥修复过程中的优势菌群，明确底泥菌群转化规律，以期为黑臭水体治理工程提供一种经济且高效的技术方法.

1 材料与方法

1.1 样品采集及预处理

试验底泥采自白洋淀与大清河流域(雄安新区)某污水库纳污坑塘(38°47′50″N、115°39′43″E).利用彼得森采泥器收集深度为0.4～0.8 m受污染底泥，去除枝叶和石块等杂质，装入自封袋；采集20 L河水装入采样桶用作试验上覆水.将密封好的底泥、水样样品迅速运回实验室，储存于4 ℃冰箱中，避光保存.

1.2 底泥及上覆水修复

常温下，利用氮吹仪将底泥样品中的植物残渣和细沙砾去除并搅拌均质.称取1 kg底泥样品倒入有机玻璃柱容器底部并投加硝酸钙修复剂，硝酸钙用量分别占底泥质量的0.5%和1.2%，充分搅拌直至全部溶于湿泥中，分别记作C1和C2组.为防止过量的硝酸钙向水体释放，将未经处理的底泥覆盖在已处理底泥上方(厚约2 cm)，再将2 L河水水样缓慢注入玻璃容器中，密封容器以防止水分蒸发.重复上述步骤，利用气体流量计控制曝气速率(0.05～0.10 m3/h)对底泥界面上方进行持续低氧曝气，分别记作CH1和CH2组.设置3组平行试验，并做空白组对照，试验周期为30 d，分别在第1、2、3、5、7、10、14、21、30天采集水样和泥样进行指标测定.

1.3 高通量测序

采用1%的琼脂糖凝胶电泳完成样本DNA组提取，利用PCR扩增仪(ABI GeneAmp® 9700型)对底泥样品细菌的16S rRNA进行扩增，设计引物及序列分别为338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT).反应参数：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，并循环27次；72 ℃延伸10 min，终止温度为10 ℃；扩增产物作为变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)上样样品进行终测.通过Illumina MiSeq平台获得细菌物种分类的OTU (operational taxonomic unit)，并将所有序列进行OTU划分，对97%相似水平的OTU利用QIIME软件进行生物信息统计分析[15].

1.4 检测指标及分析方法

水温、pH、ρ(DO)和ORP采用水质多参数测定仪(WTW，Multi360 IDS，北京博峰天成科技有限公司)测定；上覆水中ρ(TN)、ρ(NH3-N)、ρ(NO3--N)和ρ(TOC)分别采用HJ 11894—1989《碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》、HJ 535—2009《纳氏试剂分光光度法》、HJ/T 346—2007《紫外分光光度法》和GB 13193—1991《非色散红外线吸收法》测定；底泥中w(NH3-N)和w(NO3--N)采用HJ 634—2012《氯化钾溶液提取-分光光度法》测定，w(AVS)采用酸化-吹气法[10,16]测定.底泥-上覆水体系中各指标背景值如表1所示.

表1 上覆水及底泥指标背景值Table 1 Background value of sediment and overlying water index

2 结果与讨论

2.1 底泥-上覆水体系中指标变化

2.1.1上覆水中pH、ρ(DO)及ORP变化

上覆水中pH、ρ(DO)、ORP指标如表2所示.由表2可见，4个处理组上覆水中pH无显著变化，第30天时pH稳定于7.29～7.44之间，接近上覆水原样(空白组)中pH.该结果与王霖等[3]的研究结果基本一致，表明底泥生化过程形成如硫化物、亚硝酸盐和硝酸盐等产物并不对水体pH产生显著影响.

表2 各处理组上覆水中pH、ρ(DO)、ORP指标第30天时测定值Table 2 Variation in the 30 day of pH,DO and ORP in overlying water of each processed group

未经曝气的C1和C2组的ρ(DO)与空白组相比，ρ(DO)呈现小幅上升，这可能是由于大气复氧和试验采样对水体进行扰动所致，但总体上ρ(DO)恢复效果较差.而CH1和CH2组上覆水在低氧曝气的条件下，其ρ(DO)在第30天时分别升至3.70和4.08 mg/L.CHANG等[17]研究表明，低氧修复可增加底泥-上覆水体系电子受体，增强水体和底泥临界处兼性菌群的活性，并促进有机质或还原性污染物的降解转化，从而提高底泥-水覆水体系的自净能力.此外，CH组的底泥间隙水ρ(DO)在试验期内也呈现类似的提升，这表明在底泥-上覆水体系完成了良好的氧传递，ρ(DO)的升高可为底泥兼性微生物提供有利的生长条件.

空白组ORP在30 d内均保持在0 mV以下.由于硝酸钙具有较强氧化性，第30天时C1和C2组ORP分别升至5.44和-16.75 mV.研究[18]表明，水体中ORP与ρ(DO)有显著相关性，经过低氧处理的CH1和CH2组上覆水中ORP在第30天时分别达101.20和119.89 mV，比C组提升更明显.ORP的升高可为底泥-水覆水体系中的脱氮菌群创造适宜条件，并抑制SRB、产甲烷菌等厌氧微生物释放的H2S或CH4等气体[19-20].

2.1.2底泥-上覆水体系中氮素转化及有机质去除

底泥-上覆水体系中NH3-N含量变化规律如图1所示.水样初始ρ(NH3-N)为10.48 mg/L，空白、C1和C2组的ρ(NH3-N)在第30天时分别升至11.63、11.99和12.45 mg/L〔见图1(a)〕，其主要是底泥中NH3-N向上覆水扩散迁移造成.此外，投加至底泥中的硝酸盐参与DNRA过程也可能会导致水体中ρ(NH3-N)升高，因而仅投加硝酸钙并不能有效去除水体中NH3-N，反而可能会加剧底泥中NH3-N的形成和累积[2,21].CH组ρ(NH3-N)变化趋势大致可分为3个阶段：由于底泥中NH3-N的扩散作用，0～7 d上覆水中ρ(NH3-N)逐渐升高；7～21 d，水体中ρ(NH3-N)快速下降，这表明随着水体中ρ(DO)升高，NH3-N作为耗氧污染物被迅速转化降解[22]，因此呈现与C组ρ(NH3-N)变化的差异；21～30 d，ρ(NH3-N)下降速率减缓，水体氮转化过程趋于稳定，第30天时，CH1和CH2组上覆水中ρ(NH3-N)分别降至7.47和6.82 mg/L.

图1 试验期内各处理组底泥-上覆水体系中NH3-N含量的变化Fig.1 Changes of NH3-N in sediment-overlying water system of each processed group during the experiment

底泥(以干质量计，下同)中w(NH3-N)的变化规律如图1(b)所示.试验期内空白组中w(NH3-N)稳定在0.35～0.37 mg/g之间，由于硝酸钙的投加为底泥微生物提供了电子受体及化合态的氧[23-24]，有利于兼性硝化菌群的繁殖增长，使NH3-N在微生物作用下参与了硝化过程，从而有效降低了底泥中w(NH3-N).同时，CH组在低氧曝气条件下，其上覆水与底泥间存在氧传递作用，加速了表层底泥NH3-N的氧化过程.因此，各不同处理组中w(NH3-N)从第3天起均呈现明显下降，第10天后C1和C2组对NH3-N降解速率减缓，最终去除率分别为42.2%和57.3%.而CH1和CH2组对底泥中NH3-N的去除效率显著优于C组，其NH3-N去除率分别为66.2%和76.8%.该结果表明，随着泥水体系中ρ(DO)的缓慢提升及硝酸钙盐对微生物的激活，底泥由厌氧环境逐渐向缺氧或好氧环境转变，NH3-N被逐渐氧化去除，有效降低了NH3-N重新向水体释放，导致水体黑臭反复发生.

图2 试验期内各处理组底泥-上覆水体系中NO3--N含量的变化Fig.2 Changes of NO3--N in sediment-overlying water system of each processed group during the experiment

底泥-上覆水体系中NO3--N含量的变化规律如图2所示.由图2(a)可见，4个处理组的水体中ρ(NO3--N)均不同程度升高.未经曝气C1和C2组NO3--N从底泥中释放并在上覆水中逐渐累积，在第7天时分别达34.04和44.95 mg/L.7～30 d时，C1和C2组ρ(NO3--N)呈下降趋势，这可能是因底泥的吸附作用和厌氧环境下DNRA硝酸盐异化还原成铵过程导致其浓度降低，并在第30天分别降至24.39和36.13 mg/L.CH1和CH2组上覆水中ρ(NO3--N)在试验期内一直保持累积的趋势，第30天时分别达15.83和22.62 mg/L，均低于C组，这主要是由于CH、C组底泥微生物对NO3--N利用速率不同所致〔见图2(b)〕，投加硝酸钙后，C1、C2、CH1和CH2组底泥中w(NO3--N)快速上升，1～2 d内达最高值，分别为0.67、1.35、0.65和1.31 mg/g，且根据投加剂量的不同，最高值也呈现出不同梯度.除部分NO3--N向上覆水释放外，在反硝化的作用下，底泥中w(NO3--N)在第3天开始快速下降，且CH组底泥中w(NO3--N)的降低速率明显快于C组.由于低氧曝气作用，改善了底泥菌群的DO条件和微生态环境，好氧或兼性好氧菌群快速繁殖[24]，使NO3--N作为电子受体被微生物更快速的利用[4]，有效减缓了NO3--N向上覆水的释放量.C1、C2、CH1和CH2组底泥中w(NO3--N)在第30天分别稳定至0.03、0.08、0.02和0.05 mg/g，均接近初始值(0.08 mg/g)，底泥中w(NO3--N)快速降低有利于实现底泥矿化及改善底泥生态环境.Yamada等[9]认为，当水生环境中ρ(NO3--N)和ρ(NO2--N)累积到一定水平时，就被初级生产者同化为氮源或通过细菌脱氮转为N2.若ρ(NO3--N)剧烈升高，会对浮游动植物及底栖生物造成危害，当投加硝酸钙第85天时，水体中ρ(NO3--N)最高为253 mg/L，受试蕨类植物Ceriodaphniasilvestrii保持极高的死亡率.Sueitt等[11]发现，当水体中ρ(NO3--N)分别累积至76.72和296.46 mg/L时，分别达到受试蕨类植物Ceriodaphniasilvestrii和受试动物Chironomusxanthus的半数有效浓度(EC50).C1、C2、CH1和CH2组1～30 d试验期内上覆水中ρ(NO3--N)平均值依次为28.38、40.52、13.81和20.86 mg/L，均低于上述参考数值.采用硝酸钙投加法，必会造成部分NO3--N向上覆水的释放和累积，相对于NH4+-N及NO2--N，其毒性较小，但长期累积仍有危害[7-9].因而利用低剂量硝酸钙对底泥进行修复，虽造成上覆水中ρ(NO3--N)升高，但对水生生物造成的生态风险仍处于安全可控的范围.

上覆水中ρ(TN)和ρ(TOC)在第1、10、30天的变化情况如图3所示.由图3可见，由于硝酸钙投加和底泥释放的原因，各处理组上覆水中ρ(TN)均明显上升.空白、C1、C2、CH1、CH2组上覆水中ρ(TN)平均值分别为23.86、38.96、51.47、24.24、32.25 mg/L，说明投加硝酸钙向底泥-上覆水体系引入新的氮源导致了ρ(TN)的升高.然而CH1组平均ρ(TN)相对于空白组提升并不明显，表明低剂量硝酸钙+低氧曝气条件处理方法不会导致ρ(TN)的过量累积.此外，随着底泥反硝化过程的持续进行，各处理组上覆水中ρ(TN)在30 d时均呈现下降的趋势.一般来说，硝酸钙修复黑臭底泥会引起底泥-上覆水体系TN含量的升高[9,11]，但CH组对ρ(TN)的控制好于C组，较C组降低了37.5%，结合底泥-上覆水体系对NH3-N和NO3--N良好的去除及利用效果，试验期结束后CH组上覆水中ρ(TN)仍有进一步降低的趋势.由于底泥有机污染物向水体扩散迁移，使ρ(TOC)相比于空白组有少量升高，达61.86 mg/L，且第30天相较其他试验期没有明显降低.但C1、C2、CH1和CH2组ρ(TOC)均有不同程度降低，第30天时分别为37.24、41.95、18.39和8.66 mg/L，比空白组分别下降了35.0%、26.8%、67.9%和84.9%.TANG等[4]的研究表明，硝酸钙的投加强化了底泥微生物对有机污染物的生物降解的性能，并刺激底泥脱氮菌群利用外源碳转化为内部营养并实现快速繁殖.此外，低氧曝气对底泥-上覆水体系中TOC也具备氧化降解作用，结合上述底泥-上覆水系统脱氮结果表明，低剂量硝酸钙联合低氧曝气可实现碳、氮的同步去除.

图3 不同试验期各处理组上覆水中ρ(TN)、ρ(TOC)的变化规律Fig.3 Changes of ρ(TN) and ρ(TOC) in overlying water of each processed group during different experimental periods

2.2 底泥AVS去除

各处理组底泥中w(AVS)变化及CH2组底泥颜色变化如图4所示.由图4可见，底泥中初始w(AVS)在5.2～5.5 mg/g之间，第30天时，空白组w(AVS)基本保持不变，而C1和C2组AVS去除率分别为23.7%和40.7%，CH1和CH2组AVS去除效果更为显著，AVS去除率分别高达90.7%和97.4%.随着试验的进行，CH组的底泥颜色也由接触上覆水一侧向下产生变化，从深黑色逐渐转变为土黄色或褐黄色.研究[9,21,25]表明，提高投加硝酸盐剂量可增大AVS的降解速率，促进底泥菌群对有机物的利用和分解，但过量的硝酸盐将增加河流及湖泊的生态风险.因此，该试验在低氧曝气辅助作用下，为底泥-上覆水体系提供了因硝酸钙剂量降低而缺失的电子受体，以DO作电子受体更易被底泥好氧或兼性菌群利用[26]，从而实现了底泥中AVS的氧化去除.由表3可见，该修复技术处理周期短，硝酸钙用量少，对底泥AVS的去除率高，且ρ(DO)及ORP的提升将有助于增强体系的自净功能.

(a) 各处理组底泥中w(AVS)变化

(b) CH2组底泥颜色变化图4 各处理组底泥中w(AVS)变化及CH2组颜色变化规律Fig.4 Changes of w(AVS) in sediment of different processed groups and color of group-CH2

2.3 高通量测序分析

鉴于CH2组对底泥的修复效果最优，选取第5、10、15、30天的CH2组底泥样品进行高通量测序，其序列信息及多样性数据如表4所示.样品有效序列数均高于 30 000 条，样品覆盖度均达0.99，表明底泥样品的测序结果可真实表达微生物的多样性特征.Ace指数可反映样品细菌群落的丰富度，5个测试样品的Ace指数均在224.4～266.2之间，表明底泥细菌群落的丰度基本相似.Shannon-Wiener指数及Simpson指数可全面反映样品群落中物种的多样性，Shannon-Wiener指数越大或Simpson指数越小则表明群落中各物种均匀度越大，物种多样性越好，同时也表明优势菌种占样品生物总量的比值越低.由表4可见，CH2组在第30天相较于其他时期Shannon-Wiener指数较低且Simpson指数较高，表明投加硝酸钙联合低氧曝气方法在一定程度上降低了底泥菌群的多样性，促进了优势菌群的转化.

底泥样品菌群在纲水平上微生物的相对丰度如图5所示.由图5可见，底泥原样主要以梭菌纲(Clostridia)、放线菌纲(Actinobacteria)和厌氧绳菌纲(Anaerolineae)为主要优势菌群，三者总占比约为46.8%，这主要与底泥厌氧的环境有关[29].不同试验阶段的CH2组微生物菌群结构产生了较大的改变，兼性好氧菌群竞争力得到增强，γ-变形菌纲(Gamma-proteobacteria)、β-变形菌纲(Beta-proteobacteria)、α-变形菌纲(Alpha-proteobacteria)及芽孢杆菌纲(Bacilli)等菌种相对丰度随着试验的进行也显著升高，尤其γ-变形菌纲在底泥中繁殖迅速，30 d试验期内相对丰度由6.7%增至60.0%，成为底泥优势菌种.研究[30]表明，该类微生物以底泥有机物作为电子供体，以NO3--N作为电子受体进行生物脱氮，多数反硝化细菌已被证实属于变形菌门(proteobacteria).这也证明了硝酸钙的投加为底泥反硝化菌提供了电子受体，实现了其大量繁殖.同时，随着底泥DO条件的改善，梭菌纲(Clostridia)、放线菌纲(Actinobacteria)及厌氧绳菌纲(Anaerolineae)的相对丰度分别由初始阶段的20.4%、16.2%和10.3%分别逐渐降至1.2%、6.0%和0.1%，该结果说明低氧曝气抑制了厌氧菌群的生长，促进微生物群落结构的演变，并加快了底泥-上覆水体系脱氮的过程.

表3 硝酸钙用量、试验周期及指标对比结果Table 3 Comparison results of calcium nitrate dosage,experimental cycle and index

表4 底泥微生物菌群相对丰度及多样性数据Table 4 Relative abundance and diversity data of bacterial community in sediment

图5 底泥样品在纲水平上微生物的相对丰度Fig.5 Microbial abundance of sediment samples at the Class level

图6 底泥样品在属水平上微生物的相对丰度Fig.6 Microbial abundance of sediment samples at the Genus level

底泥样品菌群在属水平上微生物的相对丰度如图6所示.底泥原样微生物具有较高多样性，各物种相对丰度比较均匀.热单胞菌属(Thermomonas)相对丰度在第10天升至9.6%；肠杆菌属(Enterobacter)相对丰度从初始阶段0.1%逐渐升至第30天的12.3%，这些菌种属于异养反硝化菌[31]，进一步证实投加低剂量硝酸钙联合低氧曝气可以实现底泥修复过程中反硝化作用.第15天时，硫杆菌属(Thiobacillus)的相对丰度由0.1%增至16.3%，该菌属可氧化H2S、S2O3等物质并有效阻断AVS的生成，与SRB形成强烈的竞争关系，抑制其生长繁殖[32-33].第30天时，产黄杆菌属(Rhodanobacter)成为底泥修复过程中的优势菌种，其相对丰度达38.7%，该菌种属于革兰氏阴性菌，具有好气性，其存在也证明了底泥氧环境的改善.上述菌种大多具备氨氧化、亚硝酸氧化和反硝化功能[3,34-35]，是底泥氮转化及有机物分解的主要参与者，这对底泥氮转化及有机质的降解起到关键作用.

3 结论

a) 利用低剂量硝酸钙+低氧曝气技术对黑臭底泥进行修复，当硝酸钙用量占底泥质量1.2%、持续低氧曝气(0.05～0.10 m3h)的修复效果最优.上覆水中ρ(DO)由0.48 mg/L升至4.08 mg/L，ORP由-58.60 mV升至119.89 mV.

b) 投加药剂后底泥硝酸钙含量快速升高，并在短期内降至初始水平，减小了因NO3--N含量急剧变化引起的潜在危害；CH组对TN的控制好于C组，其上覆水中ρ(TN)平均值较C组降低了37.5%；CH2组上覆水中TOC、底泥中NO3--N和AVS去除率平均值分别达84.9%、76.8%和97.4%，底泥颜色由深黑色转变为土黄色.

c) 微生物多样性因底泥条件改变而降低，其优势菌种由梭菌纲(Clostridia)转变为γ-变形菌纲(Gamma-proteobacteria)，CH2-30 d菌种相对丰度达60.0%.在细菌属水平上出现产黄杆菌属(Rhodanobacter)、硫杆菌属(Thiobacillus)和热单胞菌属(Thermomonas)等反硝化菌群.低剂量硝酸钙+低氧曝气技术可促进脱氮功能菌群的生长，实现了对底泥高效的原位修复.