化痰散结方含药血清体外抗胃癌作用

王华 郭维 孙琪

【摘要】 目的：研究化痰散结方含药血清对胃癌细胞株增殖抑制作用。方法：以MGC803和MKN45胃癌細胞株为研究对象，加入化痰散结方含药血清，CCK-8法检测化痰散结方含药血清对2种胃癌细胞株增殖抑制作用。结果：化痰散结方含药血清对MGC803和MNK45胃癌细胞均具有抑制作用，其中对MGC803胃癌细胞最佳干预浓度为20%，最佳干预时间为48 h;对MKN45胃癌细胞最佳干预时间为72 h，最佳干预浓度为20%。结论：化痰散结方含药血清对胃癌细胞株的增殖具有抑制作用，为后期开展实验研究奠定基础。

【关键词】 化痰散结方 含药血清 胃癌细胞增殖

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.07.003  文献标识码 A  文章编号 1674-6805（2020）07-000-03

Anti-gastric Cancer Effect in Vitro of Huatan Sanjie Prescription Containing Drug Serum/WANG Hua， GUO Wei， SUN Qi. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（7）： -8

[Abstract] Objective： To study the inhibitory effect of Huatan Sanjie Prescription on proliferation of gastric cancer cell lines. Method： The MGC803 and MKN45 gastric cancer cell lines were taken as the research object， adding Huatan Sanjie Prescription containing drug serum， and the CCK-8 method was used to detect the effect of Huatan Sanjie Prescription containing drug serum on the proliferation inhibition of the two gastric cancer cell lines. Result： The Huatan Sanjie Prescription containing drug serum had cytotoxic effects on both MGC803 and MKN45 gastric cancer cell lines. The optimal intervention concentration for gastric cancer cells of MGC803 was 20% and the optimal intervention time was 48 h， for MKN45 gastric cancer cells， the optimal intervention time was 72 h and the optimal intervention concentration was 20%. Conclusion： The serum containing Huatan Sanjie Prescription has inhibitory effect on the proliferation of gastric cancer cell lines， which laid a foundation for the later experimental research.

[Key words] Huatan Sanjie Prescription Containing drug serum Cell proliferation in gastric cancer

First-authors address： Traditional Chinese Medicine School of Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China

胃癌（gastric cancer，GC）是在亚洲地区常见的消化道肿瘤，因其侵袭和转移致患者预后极差，死亡率很高[1]。因此，增加对GC发病和进展的理解，可能有助于改善临床和治疗。中医认为，痰浊与胃癌的发病有密切关系。痰的特点是胶着难去，随气升降，无处不到[2-3]，其特点与肿瘤的特性十分相似。《丹溪心法》曰：“凡人身，上中下有块者，多是痰。”这也充分说明痰与肿瘤的关系[4]。基于此理论，化痰法治疗肿瘤成为临床常用的一种大法，本课题组前期自拟化痰散结方治疗胃癌，取得较好的疗效，进一步从基础实验探索其作用机制，具体如下。

1 材料与方法

1.1 细胞和动物

MGC803和MKN45人胃癌细胞株（两株细胞系均购于中国科学院上海生科院细胞资源中心）;健康SD雄性大鼠10只，由宁夏医科大学实验动物中心提供[许可证号SCXK90（宁）2015-0001]。

1.2 药物

化痰散结方由以下药物组成：半夏15 g，天南星15 g，浙贝10 g，生牡蛎30 g，全蝎6 g，地龙6 g，守宫6 g，乌贼骨15 g，炙甘草6 g，木蝴蝶15 g，凤凰衣15 g，刺猬皮10 g，山甲粉3 g，蜈蚣6 g，藤梨根15 g（制成的水煎剂浓度为1.56 g/ml），由宁夏医科大学附属回医中医医院提供。

1.3 试剂

四季清胎牛血清（浙江天杭生物科技公司）;CCK-8试剂 （日本同仁化学）;胰蛋白酶 （北京索莱宝生物有限公司），RPMI-1640培养基（HyClon公司）。

1.4 仪器

恒温CO2培养箱HF-90 （Thermo Scientific） ;倒置顯微镜CKX31 （OLYMPUS Corporation） ;连续波长及核酸蛋白微量检测酶标议（Tecan瑞士）。

1.5 方法

1.5.1 含药血清的制备 SD 大鼠10只，体重（180±20）g，适应性饲养7 d 后，随机分为空白组和给药组，每组5只。给药组给予化痰散结方药液，每日灌胃，2 ml/次。空白组给予等量生理盐水，两组均连续灌胃7 d。末次灌药（灌药前禁食不禁水12 h）2 h 后，10%水合氯醛麻醉，心尖采血，静置2 h后，3 500 r/min离心10 min 后收集血清，同组血清混合置于离心管中，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-80 ℃分装保存备用。

1.5.2 细胞培养及分组 MGC803和MNK45胃癌细胞分别接种于T25的培养皿中，在5% CO2 、37 ℃培养箱中培养，待细胞生长成对数生长期进行实验。按照处理条件不同分组为空白血清组（10%空白血清）、5%组（5%含药血清）、10%组（10%含药血清）、15%组（15%含药血清）和20%组（20%含药血清）。

1.5.3 CCK-8法检测胃癌细胞株增殖 用胰酶消化处于对数生长期细胞，用培养基分别稀释成细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μl（MGC803，6×103个/孔;MKN45，5×103个/孔），培养24 h，待细胞贴壁。弃去原有培养液，加无血清培养液，饥饿12 h后，分别加入含药血清或空白血清培养液100  μl，继续分别培养24、48、72 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液，再培养1 h。用酶联免疫检测仪在波长450 nm处读取光密度（OD值）。每组每时段均设3个重复孔。抑制率计算方法：抑制率（%）=（给药组平均OD值-空白组平均OD值）/给药组平均OD值×100%。

1.6 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行数据分析，计量资料以资料（x±s） 表示，采用单因素方差分析， 组间比较用LSD，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 化痰散结方含药血清对MGC803胃癌细胞株增殖的影响

10%组、15%组及20%组24 h内OD值均低于空白血清组，5%组、10%组、15%组及20%组48、72 h内OD值均低于空白血清组，随着药物浓度及时间的增加，抑制率也随之升高，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2 化痰散结方含药血清对MKN45胃癌细胞株增殖的影响

5%组、10%组、15%组及20%组48、72 h内OD值均低于空白血清组，随着药物浓度及时间的增加，抑制率也随之增加，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

3 讨论

CCK-8检测法的特征是操作简单，结果稳定，重复性佳，比MTT检测法对实验人员的毒副作用较安全[5]。

目前手术加化疗是胃癌最常见的治疗手段，但其化疗副作用显著，严重影响人们的生活质量。中医药能够改善患者生活质量，减轻化疗毒副反应，提高化疗耐药[6-7]，其作用机制值得深入探索。

化痰散结方含药血清对MGC803和MNK45胃癌细胞均具有抑制作用，其中对MGC803胃癌细胞抑制作用较好，最佳干预浓度为20%，最佳干预时间为48 h。对MKN45胃癌细胞最佳干预时间为72 h，最佳干预浓度为20%。为本实验后续的高通量测序提供基础。中药复方抗肿瘤的机制尚不明确，需要进一步对肿瘤移植到动物体内进行体内抗肿瘤实验研究。

肿瘤乃有形实邪，治疗多以“结者散之”“坚者削之”法[8]。临床研究发现，化痰散结法联合化疗治疗中晚期胃癌，改善患者生存质量，增效减毒[9-10]。实验研究表明温阳化痰散结方对患乳腺癌荷瘤鼠具有抑制肿瘤生长，改善生存期[11]。有学者运用化痰散结类中药，抑制肿瘤生长转移[12-14]，逆转耐药[15]。

胃癌当属于中医学“积聚”“癥瘕”等范畴。《疡科心得集》云：“癌瘤者， 非阴阳正气所结肿， 乃五脏瘀血浊气痰滞而成。”导师郭维在临床诊治中体会到，肿瘤并非单一邪气所为，也非单纯的寒证和热证，而是寒热胶结[16]，再与痰瘀等邪气相合，日久成积化毒致癌。故拟此方，本方由半夏、天南星燥湿化痰，浙贝、生牡蛎软坚散结，此四药共为君药。全蝎、地龙、守宫、蜈蚣和山甲粉通络散结共为臣药。现代药理学研究证明一些动物药中所含的成分具有抑制或杀灭癌细胞、增强机体对肿瘤的免疫力、抑制转移、止癌性疼痛等作用。木蝴蝶和胃，凤凰衣养阴，刺猬皮散瘀止痛，乌贼骨制酸消炎止痛，藤梨根清热解毒活血共为佐药。炙甘草调和诸药为使药。该方辛开苦降，寒热并用，具有化痰散结，和胃止痛，养阴解毒之功。

综上所述，化痰散结方含药血清对胃癌细胞株的增殖具有抑制作用，为后期开展实验研究奠定基础。

参考文献

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（收稿日期：2019-11-06） （本文编辑：马竹君）

基金项目：宁夏高等学校一流学科建设（中医學学科）资助项目

（项目编号：NXYLXK2017A06）

宁夏回族自治区自然科学基金项目（项目编号：NZ17076）

①宁夏医科大学中医学院 宁夏 银川 750004

②宁夏医科大学回医药现代化教育部重点实验室

通信作者：郭维