化学品生物降解的评价方法

罗朝阳

（达州职业技术学院，四川达州635001）

随着合成有机物的生产和使用逐年增加，其大部分不易被分解，残留在生态环境中，对生态环境以及人和动植物的生存构成巨大的危害。生物降解（biodegradation）是有机物在生态环境中变化的主要机制[1]，其定义为有机化学品（污染物）在环境中的微生物酶的作用下，发生一系列的生物化学反应（如氧化、还原、水解、脱氢、脱卤等），使复杂的有机化合物转化为简单的有机物或无机物（如CO2和H2O）的生物化学反应过程[2]。生物降解是一个综合的生物化学反应，一般都分为多个步骤进行，根据降解反应的进行程度不同，一般可分为初级和最终生物降解[3]。

（1）初级生物降解（Primary biodegradation）指有机化学品的分子结构在微生物分泌的酶的作用下分子发生改变，母体分子骨架发生初级生物降解，从而导致其失去原有的化学性质[4]；

（2）最终生物降解（Ultimate biodegradation）指化学品的分子结构完全被微生物破坏，其分子作为微生物生长繁殖所需要的碳来源和能量来源，最终生成无机盐、CO2和H2O（这是一个矿化的过程），即完全被微生物降解利用。

由于初级生物降解不完全，初级生物降解产物在一定程度可能会继续对生态环境造成危害，而最终生物降解的产物为能够被环境利用或者可以转化成有益于整个生态环境的能量[5]。因此，也有人提出更为完整的生物降解过程包含三个过程[6，7]：一是初级生物降解（母体结构发生改变导致理化性质发生变化）；二是环境可接受的生物降解（降解的各级产物都不会污染生态环境）；三是最终生物降解（有机物完全被生物矿化）。

化学品生物降解的测定是在化学品作为微生物的唯一碳源和能量来源的条件下进行的，包括化学品在微生物中的曝露过程和化学品因生物降解而消失过程中的定量分析[8]。

1 化学品在微生物中的曝露

研究化学品在微生物中的曝露方法时，必须考虑菌种的选择和降解条件等主要的影响因素：

对于实验系统中菌种的选择，通常有三种方法：⑴使用从被测物的实际降解过程的环境中采集的微生物（包含活性微生物的活性污泥）作为实验用的菌种；⑵选用按实验规定的混合的微生物菌种进行生物降解实验（混合菌种法）；⑶ 采用单一的微生物菌种作为实验接种的菌种（纯菌种法）。但是，无论采用哪种菌种，都需要考虑驯化方法和驯化时间的问题，并且要在曝露实验测定方法中进行规定，以避免不同实验方法带来的不同结果。

其次还要考虑曝露实验是在好氧，还是厌氧条件下进行的。曝露实验具体方法主要有[9]：

⑴ 河水衰减试验（River die way test）：模拟天然水体环境中的曝露条件。河水衰减试验是在实验室中用适量的河水与有机物混合，在室温下进行恒温培养，然后测定生物降解率。该方法虽然能够模拟有机物在自然环境下的降解过程，但是由于河水中微生物的量相对较少，使得反应时间较长，并且由于各地的河水不同，也有较大的实验误差，因此实验室不宜采用河水衰减法进行曝露实验。

⑵振荡培养法（Shake flask test）：按实验规定的程序进行接种、驯化菌种后，将有机物和菌种置于振荡瓶中，将瓶置于振荡器上在一定的温度条件下振荡一定时间进行曝露实验（好氧条件下的曝露实验）。国家标准GB/T 15818-1995摇瓶试验法原理就是振荡培养，其微生物源取处理自民用生活废水的污水处理厂，该方法是将活性污泥和表面活性剂加入含有微生物培养液的介质中，按规定方法进行培养和测定样品的浓度变化。该方法操作简单，可重现性也较好，其应用比较普遍[9]。

⑶半连续活性污泥法（SCAS）或连续活性污泥法（CAS）：模拟污水处理厂中的曝露条件。连续活性污泥法是以一定量的有机化学品和含营养物质的人工污水连续进入含活性污泥的装置中，测定化学品进出口的浓度变化，得到其生物降解度[9]；半连续活性污泥法则是化学品和营养物质按一定的浓度逐天增加，以诱导微生物产生分解化学品的生物酶（诱导选择过程）。两种实验方法都是使用活性污泥，模拟城市污水处理厂的生物处理过程。使用活性污泥模拟污水处理的测定方法类似实际过程，但有时间长、操作条件不易控制、数据的重现性差等缺点。

⑷ 密闭瓶法（Closed bottle test）：按实验规定的程序接种和驯化菌种，将被测物和菌种置于密闭试验瓶中，静置一定时间后进行曝露实验（厌氧条件下的曝露实验）[9]。

2 被测物的定量分析

评价化学品的降解度的方法有很多，随着化学品的不同，其评价方法也不同，因此需要注意各种方法本身的适用范围以及局限性，以及不同定量评价方法所得到结果的差异性。有机物的去除率、耗氧量、最终产物量和微生物及其活性,都可以用于有机物的好氧生物降解性的定量分析。常用的研究化学品生物降解度的方法可以分为以下几类：

⑴表面活性法

表面活性法通常用于测定具有表面活性的物质，如皮革加脂剂、表面活性剂等。具体的测试方法通常包括：① 泡沫法（通过测定泡沫的高度进行测试）；② 表面张力法(测定有机物溶液表面张力的变化)；③ 极谱法（polarography,测定其胶束浓度）。表面活性法用于测定具有表面活性的物质的初级生物降解，虽然这是一种快速的方法，但是在一些情况下并非是有效的方法，因为表面活性的测定容易受微量杂质干扰，所以该方法只是在没有合适的专门分析方法时才适合使用。

⑵专用化学法

根据有机化合物的不同，采用的专用分析手段也不同，如使用亚甲蓝法（MBAS）测定阴离子表面活性剂的浓度变化[10]，该法具有灵敏度高、操作方便、测定快速等优点，得到了较为广泛的应用。此外，分析含EO基团的非离子表面活性剂的碘铋法（BIAS）和硫氰酸钴法（CTAS）等方法都成了定量分析的经典方法[11]。

⑶物理化学法

常用的物理化学分析方法包括：①高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱法；②薄层色谱法（TLC）；③电泳法；④气象色谱法；⑤放射性元素示踪技术法；⑥光谱法；⑦电化学法；⑧其它波谱分析法如：红外（FTIR）、紫外（UV）、核磁共振（NMR）、气质联用（GC-MS）等。物理化学法是研究化学品的生物降解机理和生物降解过程的最为有力的工具。

⑷与代谢有关的非特定方法

一般认为，最终好氧生物降解是以下式为基础[12]：

测定物质(DOC)+O2→CO2+H2O+生物量

因此，溶解有机碳（Dissolved Organic Carbon,缩写为DOC)、生物化学需氧量 (Biochemical Oxygen Demand,缩写为BOD)及二氧化碳排放量(CO2)、化学耗氧量（Chemical Oxygen Demand,缩写为COD）等都可用于表征化学品的最终生物降解性[13]。

二氧化碳排放量法是在一定的时间内测量生物降解反应所生产的CO2的量来计算降解率，但是由于生物降解反应的产物除了CO2外往往还有其他物质（碳也有可能转化成微生物的生物量），所以使用该法测定时测量结果往往都会偏低。2006年，OECD（世界经合组织）发布了密闭瓶二氧化碳法[14]，该方法是一种能够快速评价生物降解的测试方法，该方法除了测定降解产生的二氧化碳外，还使用了分析测试设备测定无机碳的生成量，从而能够更加有效地评价生物降解，因此该分析方法得到了广泛的使用。

BOD（生化耗氧量）指有氧的条件下，好氧微生物使化学品降解所耗费的氧气的量。图1[15]为有机物的好氧生物降解和好氧微生物细胞物质的合成示意图，BOD即为Oa和Ob之和。生物耗氧量越高，意味着水中的易降解的化学品越多。生物耗氧量法只适用于需氧条件下的生物降解，通过测定化学品的生化耗氧量可测定一定时间化学品生物降解的程度，化学品的最终浓度可以通过测定溶解的总有机碳进行间接测定。

图1 有机物氧化和微生物细胞合成关系Fig.1 The relationship between the oxidation of organic compound and the synthesis of microbial cell

在BOD测试中，最常用的参数为最后一天的生物化学需氧量(BODu)与理论耗氧量(ThOD)的比值，可直接反映化学品的可生物降解程度[16]。

COD指用氧化剂（常用重铬酸钾）氧化化学品所耗费的氧气量。但重铬酸钾法对于测定污染程度低的水样不适用，因此测量天然水体的COD一般采用高锰酸钾法或耗氧量法[17]；同时，值得注意的是对于同一水样的测定，重铬酸钾法一般偏高。

⑸微生物特定的生理生化指标法

生物降解的定量分析也可以通过微生物的活性进行检测。微生物的活性是通过微生物细胞内特定酶的活性（ATP、脱氢酶等）进行反映。但是DHA一般只能反映特定的微生物种群的生物活性，而不能反映系统中所有微生物的活性，因此DHA法的使用受到了很大限制[18]。

⑹放射性同位素示踪法

放射性同位素示踪法是指用14C或其它元素的放射性的同位素合成被测化学品，在生物降解过程中通过测定中间产物、剩余物质、微生物细胞内、气体产物及其它产物中的14C或者其它同位素，达到了解降解历程的目的，从而在理论上分析生物降解的各个细微过程。但是当化学品组成不明或者成分复杂时，就很难用具有放射性的同位素来合成[19]，因此该方法没有得到广泛的应用。

总的来说，由于生物降解实验的干扰因素多，不同的实验方法和检测条件可能会得到不同的降解数据和降解结果，甚至有可能无法对比不同方法得到的实验结果，但是这些方法在一定程度能反映有机化学品在自然环境中潜在的生物降解能力，所以在很多标准规定的测试方法里可用上述参数表征化学品的生物降解性能[12]。

3 有机物厌氧生物降解的评价方法

在厌氧的环境中，厌氧微生物往往能够降解好氧微生物难以降解的化学品，使用厌氧生物降解的方法具有产生污泥少、运行成本低以及可以回收生物燃料等特点[20]。有机物的厌氧生物降解在有机废水的处理中得到了一些应用，并逐渐受到广泛的关注。一般地，有机化合物的厌氧生物降解是按下式进行：

因此评价化学品的厌氧生物降解特性可以用反应前后有机物基质的浓度变化、产生甲烷和二氧化碳的量、微生物的活性等进行表征[21]。与好氧生物降解性评价的不同方面表现为：评价有机物厌氧生物降解的产气量可用测定气体体积或气体中碳的量来进行表征[22]。

4 其它降解方法

当前世界污染物处理技术研究的比较活跃领域是利用催化氧化技术（如光、电、声、磁等）、超临界水氧化技术、利用新材料（如半导体材料）作为催化剂的光催化氧化技术、湿式氧化技术等进行污染物处理，这些方法尤其适用于致癌、致基因突变、致畸的有机污染物[23]。其中光催化氧化技术由于在光催化反应过程中产生的羟基自由基的氧化性非常强，可以氧化大多数的有机污染物，并且氧化没有选择性，因此具有较大的优势。光催化氧化常见的半导体催化剂为TiO2，这种催化剂具有稳定性好、抗磨损性好、对人体和环境无毒无害、价格低廉等众多优点，使得光催化氧化技术在有机物的降解方面具有广阔的应用前景[24,25]。与常规污水处理方法相比，湿式氧化法具有二次污染低、反应速度快等优点，因而受到了人们的广泛的关注[26]。另外一个研究的热点就是利用生物膜技术处理污染物，如移动床生物膜反应器是近年来受到广泛关注的新型生物膜反应器，这是结合了生物膜法和活性污泥法优点于一体的新型的污水生物处理技术，该技术具有有机污染物去除率高、有一定的除磷效果的优点[27]。

利用超声波、微波等电磁波，以及复合磁场处理技术和电化学处理技术等也是近年发展起来的新型污水处理技术，这些技术在一定程度上能够克服利用常规方法处理污水的不足。另外，超临界水氧化、超临界流体萃取、集成化膜法、天然高分子絮凝法、零价铁还原和等离子体降解法等技术为有机污染物的处理提供了有效的途径[27,28]。

在实际工业生产中污染物的种类多种多样，往往用常规的处理方法不能解决，这就需要分析污染物的种类有针对性地使用特定的处理技术，达到污染物降解的目的。