基于网络药理学方法的二至丸治疗肝肾阴虚型崩漏作用机制研究

吉兰芳 王梦梦 崔树娜

摘要：目的  筛选二至丸治疗肝肾阴虚型崩漏的主要活性成分，预测其作用的关键靶点及信号通路，建立多成分-多靶点-多通路的网络模型，从分子水平探讨其作用机制。方法  通过多个数据库联用检索和文献挖掘，筛选二至丸的主要活性成分及其靶点，运用String平台对交集靶点进行蛋白-蛋白相互作用网络分析，利用Cytoscape3.6.1软件构建二至丸成分-靶点-通路网络，进行网络拓扑学分析，并通过生物学信息注释数据库DAVID分析靶点基因功能及信号通路。结果  筛选出二至丸主要活性成分10个，主要包括木犀草素、槲皮素、芹菜素和山柰酚等，通过调节STAT3、IL6、TNF和IL4等92个靶点，调控血管内皮生长因子、孕激素介导的卵泡成熟等29条信号转导通路。结论  二至丸主要通过影响血管功能、神经-内分泌、糖脂代谢及炎症和免疫，协同发挥止血、调节激素水平、免疫调节等作用。

关键词：二至丸;网络药理学;崩漏;肝肾阴虚;作用机制

中图分类号：R271.917.41;R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2020）04-0078-09

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201905215

Mechanism of Erzhi Pills on Liver-kidney Yin Deficiency Metrorrhagia

Based on Network Pharmacology

JI Lanfang1， WANG Mengmeng1， CUI Shuna1，2

1. Medical College of Yangzhou University， Yangzhou 225000， China;

2. Affiliated Hospital of Yangzhou University， Yangzhou 225000， China

Abstract： Objective To screen the main active components of Erzhi Pills for the treatment of liver-kidney yin deficiency metrorrhagia; To predict its key targets and signaling pathways; To establish a multi-component– multi-target–multi-channel network model; To explore its action mechanism at the molecular level. Methods Multiple database and literature mining methods was used to screen the main active components and the targets of Erzhi Pill. String database was used to perform protein-protein interaction network analysis on intersection targets， and then Cytoscape 3.6.1 software was used to construct the component-target-pathway network for network topology analysis. Target gene function and signaling pathway were analyzed through bioinformatics annotation database DAVID. Results There were 10 main active compounds， such as quercetin， luteoline， apigenin and kaempferol， were screened out from Erzhi Pills. Through regulating 92 key targets including STAT3， IL6， TNF and IL4， 29 closely metrorrhagia-related signal transduction pathways， such as VEGF pathway， progesterone-mediated oocyte maturation and so on， were regulated. Conclusion Erzhi Pills achieves the function of haemostatic， hormonal regulation and immune regulation by affecting the vascular function， neuroendocrine， glycolipid metabolism， inflammation and immune.

Keywords： Erzhi Pills; network pharmacology; metrorrhagia; liver-kidney yin deficiency; action mechanism

崩漏指經血非时暴下或淋漓不净，多发生于青春期和绝经过渡期女性。青春期少女天癸初至，肾气未充，肝失濡养，或绝经过渡期妇女天癸将绝，肾精亏虚，肝失调达，均易形成肝肾阴虚证。肝肾阴虚型崩漏的主要临床表现为经血非时而下，伴腰膝酸软、头晕耳鸣，或烦躁易怒、五心烦热、潮热盗汗，或舌红、苔少，脉弦细数。本病相当于现代医学的异常子宫出血，国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）将其定义为月经的周期频率、规律性、经期和出血量4项指标中任一项不符合正常标准、源自子宫腔的出血[1-2]，如经间期出血、功能失调性子宫出血等。目前西医治疗该病以性激素为主，但不良反应大且药物依赖性强，病情容易反复。

二至丸出自明代王三才《医便》，由女贞子（酒蒸）、墨旱莲各等份组成，其性平和、偏凉，功效补肝益肾、滋阴止血，为平补肝肾之良剂，临床用于治疗少女肾气未充、绝经过渡期妇女天癸将绝的肝肾阴虚型疾病[3]，然而，目前尚缺乏关于二至丸治疗肝肾阴虚型崩漏的物质基础和分子机制研究。近年来，网络药理学方法被广泛应用于中医药研究领域，在阐述中药及其复方治疗作用机制中显示独特优势。本研究通过多个数据库联用检索和文献挖掘，筛选二至丸的主要活性成分并进行成分靶点预测，同时检索得到肝肾阴虚证崩漏相关的靶点，分析成分-疾病的交集靶蛋白相互作用关系。并对靶点基因功能及信号通路进行分析，构建二至丸治疗肝肾阴虚型崩漏的成分-靶点网络，进行网络拓扑学分析，从而揭示其作用的分子机制。

1  资料与方法

1.1  活性化合物筛选

二至丸由女贞子和墨旱莲组成，临床常水煎口服。本研究通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）检索，以口服生物利用度（OB≥30%）和類药性（DL≥0.18）为条件筛选，得到女贞子和墨旱莲中符合条件的候选化合物，再结合国内外文献挖掘[4-5]，筛选二至丸有效化学成分。

1.2  化合物靶点查询

通过以下2个途径获得化合物靶点：①以筛选得到的化合物名称为关键词，检索CTD数据库（http：//ctdbase.org/），整理其作用靶点;②在HIT数据库（http：//lifecenter.sgst.cn/hit/）中，以化合物名称为关键词进行检索，整理其蛋白靶点后，利用Uniprot数据库（http：//www.uniprot.org/）进行归一化和标准化命名，整合出靶点，与前者合并去重，剔除非人源靶蛋白后获得二至丸调控的靶蛋白，建立中药-成分-靶点数据库。

1.3  疾病基因查询

通过PubMed数据库（https：//www.ncbi.nlm. nih.gov/pubmed/）查询“崩漏”“异常子宫出血”的标准化表达，分别为metrorrhagia、AUB。分别以“metrorrhagia”和“AUB”为关键词，检索GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/），将得到的基因进行整合，作为崩漏疾病基因。

参照《中医妇科学》[6]和《中药新药临床研究指导原则（试行）》[7]崩漏的相关内容拟定肝肾阴虚型崩漏辨证标准：①非月经期出现异常子宫出血;②腰膝酸软、头晕耳鸣;③烦躁易怒、五心烦热、潮热盗汗;④舌红、少苔、脉弦细数。以上①必备，兼有其余项即可辨证。通过GeneCards数据库（https：//www. genecards.org/）依次查找“soreness and weakness of waist and knees”（腰膝酸软）、“dizziness and tinnitus”（头晕耳鸣）、“anxiety and irritability”（烦躁易怒）、“palms and soles”（五心烦热）、“tidal fever and night sweating”（潮热盗汗）、“red tongue”（舌红）、“tongue coating less”（苔少）、“pulse string thin”（脉弦细）、“rapid pulse”（脉数）各症状对应的基因，并将其分为3组。第1组：腰膝酸软、头晕耳鸣;第2组：烦躁易怒、五心烦热、潮热盗汗;第3组：舌红、少苔、脉弦细数。分别进行组内基因去重，再组间合并，最后与崩漏疾病基因进行整合，即为肝肾阴虚型崩漏的疾病基因。

1.4  成分-疾病靶点网络构建

筛选二至丸有效成分和肝肾阴虚型崩漏疾病基因的共同靶蛋白，导入String11.0数据库（https：// string-db.org），设置蛋白种类为“Homo sapiens（人类）”，最低相互作用值为“highest confidence（0.900）”，其他参数保持初始默认设置，构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络[8-10]。

1.5  潜在靶点通路分析

GO富集分析主要涵盖生物学的3个方面：生物过程（biological process）、分子功能（molecular function）及细胞组分（cellular component）。GO分析在生物学领域中广泛用于基因功能分类[11]及预测靶点的功能分布，并能分类统计蛋白/基因的数目或组成。本研究使用DAVID6.7（https：//david.ncifcrf.gov/）对二至丸主要活性成分和肝肾阴虚型崩漏的共同基因进行GO富集分析，通过P值和错误发现率（FDR）评估存在于各GO注释中的蛋白质群[12]，以P<0.05和FDR<0.05为标准筛选，反映蛋白质群生物学功能的显著性和准确性。对潜在靶点进行KEGG分析，探求潜在靶点的信号通路分布。

1.6  靶点网络构建与分析

将二至丸治疗肝肾阴虚型崩漏的主要活性成分、靶点和疾病基因通过Cytoscape3.6.1（http：//www. cytoscape.org）软件进行可视化网络分析。网络中的节点代表化合物和靶点，边代表节点之间的相互作用，每个节点的重要性则通过拓扑参数度数进行评估，节点度指与节点相连边的数量，度值越大，表明该节点在网络中越重要。

2  结果

2.1  药物活性成分

通过TCMSP检索，并以OB≥30%、DL≥0.18为条件筛选，共得到23个药动学特征良好的化合物作为二至丸候选化合物。选取主要活性成分10个，占候选化合物的43.48%，其中女贞子的活性成分有9个，墨旱莲的活性成分有4个，两者共有的活性成分有3个，见表1。

2.2  疾病-成分靶点

通过GeneCards数据库查找获得崩漏基因1600个，肝肾阴虚证基因292个，整合后得到肝肾阴虚证崩漏疾病基因227个。经CTD和HIT数据库对二至丸有效成分进行靶点的识别，整合后获得459个成分基因，将所得靶点整合后映射到Uniprot进行蛋白标准化命名，去重后最终筛选出92个关键靶蛋白，见表2。

2.3  疾病-成分靶点网络

将String对92个交集靶点的分析信息导入Cytoscape3.6.1软件，构建PPI网络模型。点的大小与颜色反映度值大小，度值越大表明参与生物功能越多，由外到内强度递增，其中度值>30的蛋白有1个，21～30的蛋白有11个，11～20的蛋白有29个，0～10的蛋白有51个，见图1。通过CytoHubba插件中的MCC算法对PPI网络中的每个节点进行分析，筛选出排名前20位的靶点（见图2），颜色从红到黄渐变代表重要程度递减。综合图1、图2结果可以看出，二至丸治疗肝肾阴虚型崩漏的关键靶点为STAT3、IL6、TNF、IL4、IL1B、IL10、IL13、CCL2、IL17A、CXCL8、IL2、JUN和MAPK1等。

2.4  潛在靶点通路注释

通过DAVID数据库对92个预测靶点进行GO富集分析，按P<0.05且FDR<0.05条件筛选，结合文献挖掘，最终筛选出与疾病密切相关的富集结果，结果显示涉及20个生物过程、14个细胞组分、9个分子功能（见图3）。其中，预测靶点在生物过程中调控程序性细胞死亡排列和细胞死亡靠前;在细胞组分中，神经系统细胞外间隙和细胞外区域部分排列靠前;在分子功能中，细胞因子活性和生长因子活性排列靠前。

2.5  KEGG信号通路分析

通过DAVID数据库对92个潜在靶点进行注释分析，根据KEGG网站（https：//www.kegg.jp/）的通路信息及相关文献调研，筛选出与二至丸治疗肝肾阴虚型崩漏相关的通路29条（见图4），可整合归为4类：血管功能、神经-内分泌、糖脂代谢、炎症与免疫（见表3）。结果提示，二至丸可能通过表皮生长因子受体信号通路、促分裂原活化蛋白激酶信号通路、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路、细胞周期、细胞因子-细胞因子受体相互作用等发挥对血管功能的调控;与神经-内分泌相关的通路主要有孕酮介导的卵母细胞成熟、神经营养因子信号通路、促性腺激素释放激素信号通路等;涉及糖脂代谢相关的通路包括胰岛素信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路和脂肪细胞因子信号通路等;与炎症免疫相关的通路主要有T细胞受体信号通路、自然杀伤细胞介导细胞毒性、B细胞受体信号通路、趋化因子信号通路及p53信号通路等。

2.6  活性成分-靶点网络

以92个靶基因作为二至丸治疗肝肾阴虚型崩漏的关键靶点，建立活性成分-靶点网络（见图5）。该网络共有102个节点，其中，槲皮素、木樨草素、芹菜素、山柰酚为二至丸治疗肝肾阴虚型崩漏的主要活性成分。

3  讨论

系统药理学从系统水平研究药物与机体的相互作用及其规律和作用机制[13]，其最大特点是突破了传统的“单基因-单受体-单机制”研究思路和方法，以网络和系统为中心研究视角，综合分析药物对疾病的影响，适用于研究中药的“多成分-多靶点-多通路”机制。采用系统药理学方法进行中药活性成分鉴定与筛选、活性成分靶标确认和分子机制研究，可为中药药理学提供新的研究思路。

崩漏的现代医学发病机制主要为：①下丘脑-垂体-卵巢轴调节异常;②子宫内膜凝血、纤溶、生长因子和前列腺素等微环境异常[14]。二至丸及其组方药物具有显著的促凝止血作用，其作用机制可能是缩短凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间及凝血酶时间，升高血小板数量和纤维蛋白原含量[15-17];二至丸可通过上调血中雌二醇含量和靶器官雌激素受体表达，发挥雌激素样作用[18-19];操红缨等[20]研究发现，二至丸能明显改善阴虚症状，可通过提高皮质醇、胰岛素、睾酮等含量，降低血胆固醇含量，同时提高淋巴细胞增殖能力及自然杀伤细胞杀伤率而发挥作用。此外，二至丸水煎剂能降低血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶活性，对小鼠急性肝损伤有明显保护作用[21-22]。

本研究采用网络药理学方法对二至丸“成分-靶点-通路-疾病”进行网络可视化分析发现，二至丸主要活性成分包括槲皮素、木犀草素、芹菜素、山柰酚等10个化合物，STAT3、IL6、TNF、IL4、IL1B、IL10、IL13、CCL2、IL17A、CXCL8、IL2、JUN和MAPK1等可能是二至丸治疗肝肾阴虚型崩漏的关键靶基因，结合KEGG通路分析和文献挖掘认为，二至丸主要作用于VEGF、孕激素介导的卵泡成熟等信号通路。

随着卵巢性激素的周期性作用，子宫内膜相应发生增殖、分泌和脱落，内膜血管也相应发生增殖、弯曲、断裂及修复。子宫内膜血管受多种激素和生长因子调控，以靶向子宫内膜VEGF通路的研究最为全面、特异性最高[23-25]。子宫内膜生长因子与血管形成密切相关，而VEGF是最主要的促血管形成的因子，具有促进血管内皮细胞分裂、增强其通透性和刺激细胞外基质分泌的作用[26-29]。异常子宫出血患者子宫内膜孕激素受体（PR）表达水平增高，PR间接作用于无排卵性功血内膜腺上皮VEGF，抑制VEGF分泌，以致子宫内膜微血管形成障碍及结构不良，从而引起子宫不规则出血[30-31]。二至丸的多个活性成分对VEGF表达有明显调节作用，如槲皮素、芹菜素、木犀草素和齐墩果酸等。

槲皮素属于黄酮类化合物，不仅能通过调控细胞生长、增殖和凋亡的主要信号通路（如MAPK），有效抑制凝血酶诱导的血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和迁移[32-33]，抑制子宫内膜增生，而且能减少血小板聚集和释放[34]，从而发挥止血作用。芹菜素属于类黄酮中的黄酮亚类，具有多种生物学活性，如雌激素样作用、抗雌激素样作用、减少雄激素分泌、抑制胎牛血清和血小板衍生因子诱导的VSMC增殖[35-36]。此外，芹菜素还能与下丘脑内的雌激素受体结合，刺激下丘脑产生反馈样抑制作用，导致促性腺激素释放激素分泌减少，从而抑制腺垂体分泌卵泡刺激素、黄体生成素，继而抑制雌二醇和孕酮的分泌，减少内膜增生，从而控制异常子宫出血。有研究表明，木犀草素能显著增加子宫内膜厚度及其上皮细胞的高度，并具有类雌激素、抗雌激素双重作用[37]。此外，木犀草素还具有一定的抗炎活性，目前研究认为其通过抑制核因子-κB的磷酸化，减少一氧化氮和其他炎性细胞因子如白细胞介素（IL）-6的产生，发挥抗炎作用[38]。

若VEGF表达过多，血管过度增生，则子宫内膜过度增生，从而引起突破性出血。研究发现齐墩果酸可通过VEGF途径抑制内皮细胞的迁移和管腔形成[39];木犀草素对胃癌VEGF表达水平有显著的抑制作用[40];槲皮素、芹菜素等能够调节VEGF表达，影响血管新生[41-42];木犀草素能明显抑制兔角膜血管、人脐静脉血管内皮细胞中VEGF的表达[43]。在子宫内膜血管的生成过程中，VEGF不仅表达在子宫内膜的腺上皮细胞和间质细胞，侵入子宫内膜的炎性细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞）也是重要来源[44]。因此，二至丸的活性成分通过T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路及趋化因子信号通路等炎症免疫相关的信号转导通路，可以对炎性细胞进行有效的抑制，从而抑制VEGF生成，避免内膜过度增生引起突破性出血。MAPK信号转导通路可刺激IL-1等炎症因子的释放，通过介导中性粒细胞的活化和炎症聚集，从而加重血管内皮损伤。本研究结果显示，二至丸作用于MAPK信号通路中的EGFR、TNF、TP53、NFKB1、TGFB1、AKT1、MAPK1关键节点，减少炎性细胞的分泌，降低炎症反应，有效控制子宫出血。除VEGF外，孕酮介导的卵母细胞成熟也是二至丸治疗肝肾阴虚型崩漏的重要信号通路。孕酮主要通过对雌激素进行调控，使子宫内膜增生期转化为分泌期，抑制子宫内膜增厚，以药物性刮宫的形式促进血液凝固[45]。

综上所述，本研究从证候-病机-治法-组方-成分-靶点-通路-药理作用多方面阐释了二至丸治疗肝肾阴虚型崩漏的物质基础和分子机制（见图6）。

将传统中医理论与现代药理学和生物信息学手段有机结合，能充分阐明二至丸治疗肝肾阴虚型崩漏的多成分、多靶点、多效应作用特点，可为新药研发提供一定的理论依据，并为相关实验研究提供新的思路。

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（收稿日期：2019-05-15）

（修回日期：2019-06-11;编辑：陈静）

基金项目：国家自然科学基金（81703969）;江苏省自然科学基金（BK20160480）

通讯作者：崔树娜，E-mail：sncui@yzu.edu.cn