小柴胡汤加减对家兔膜性肾病的疗效

胡欢欢 尹凤仙 崔镇花

(延边大学附属医院肾内科，吉林 延吉 133000)

膜性肾病(MN)发病机制较为复杂，它是成人原发性肾病综合征常见的一种病理类型，其特点是肾小球上皮细胞下电子致密物的沉积及非炎症性病理变化，最终可导致肾小球基底膜增厚〔1,2〕。本研究通过建立用阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)制成的家兔原位免疫复合物性膜性肾病模型，用小柴胡汤加减中药方，观察其疗效，并探讨可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 白色雄性家兔28只，体重2.0～2.5 kg，适应性喂养1 w，视正常生长(期间查尿蛋白全部阴性)，随机分为正常组(n=5)；模型组(n=8)；中药组(n=8)；泼尼松组(n=7)。

1.2药物 中药复方由小柴胡汤(人参、炙甘草、柴胡、黄芩、半夏、生姜、大枣)去半夏加黄芪、灵芝、绞股蓝组成，将上述中药水煎，浓缩成每毫升含生药2 g。

1.3模型制备 C-BSA的制备参照文献〔3,4〕并加以改良。第1周预免疫：每1.5 ml磷酸盐缓冲液中(pH7.4)含大肠杆菌内毒素1 μg和C-BSA 1 mg。每只兔耳缘静脉注射1.5 ml。第2周开始正式免疫：家兔每只均耳缘静脉注射C-BSA 15 mg/d，6次/w，共4 w。第6周起剂量加倍，30 mg/w，6次/w，共2 w。正常组每日注射生理盐水2 ml。8 w后处死。

1.4给药 实验第3周开始中药组灌饲中药组按10 g/(kg·d)。泼尼松组灌饲泼尼松15 mg/d，直到第8周末处死动物为止。各实验组每日喂食颗粒饲料150 g左右，自由饮水。

1.5观察指标

1.5.1生化指标和尿蛋白测定 用磺基水杨酸法测24 h尿蛋白定量，测血清白蛋白(ALB)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、血尿素氮(BUN)及血肌酐(Scr)检查(日立公司制7150型全自动生化分析仪测定)，测定24 h尿β2-微球蛋白(MG)、尿ALB、尿免疫球蛋白(Ig)G排出量(放射免疫法测定)。

1.5.2肾脏病理学检查 ①光镜检查：实验结束时取每只兔子的部分肾组织常规HE、PAS和PAM-Masson染色，制片后光镜观察。图像分析取每个肾标本连续计数50个肾小球通过SEM-IPS图像分析系统(BH2奥林巴士显微镜，全部放大倍数400倍)测出每个肾小球的直径。②电镜及肾小球基底膜(GBM)阴离子位点检查：仿Schurer等〔5〕方法略改善，取每组两只动物肾皮质数块，用1%聚乙烯亚胺(PEI，分子量1 800 D，用等渗盐水稀释，1 mol/L盐酸溶液调节pH至7.4)浸泡30 s，再加入二甲砷酸钠缓冲液冲洗后，置于2%磷钨酸/2.5%戊二醛溶液中(0.1 mol/L二甲砷酸缓冲液稀释)室温下固定2 h，二甲砷酸冲洗后按标准方法制片，在JE-1200EX型透射电镜下观察GBM电荷染色情况及毛细血管襻超微结构。

1.6统计学处理 采用SPSS22.0软件进行方差分析及t检验。

2 结 果

2.1动物一般情况 体重：正常组动物体重平均增加0.53 kg；模型组平均增加0.18 kg；中药治疗组平均增加0.45 kg；泼尼松组平均减少0.58 kg。动物生存情况：共死亡兔4只，其中牛血清过敏反应2只(中药组1只、泼尼松组1只)；死于衰竭2只(模型组1只、泼尼松组1只)。

2.2生化指标及尿蛋白测定 实验第3周时，与模型组相比，中药组血TG、血TC，泼尼松组血TC，正常组血ALB、血TG、血TC差异均有统计学意义(P<0.01)；中药组与泼尼松组比较各生化指标无统计学差异(P>0.05)；正常组血TG、血TC与泼尼松组比较差异有统计学意义(P<0.01)。实验第8周时，与模型组相比，中药组血Scr、血ALB、血TG、血TC，泼尼松组血Scr，正常组血Scr、血ALB、血TG、血TC差异均有统计学意义(P<0.01)；中药组与泼尼松组比较血TG、血TC有显著差异(P<0.01)；正常组血TG、血TC与泼尼松组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。模型组实验第6周末24 h尿蛋白达高峰后呈明显下降趋势，第6、8周与中药组及泼尼松组同期比较差异有统计学意义(P<0.01)。实验第8周末，中药组尿蛋白排出量明显少于泼尼松组，差异有统计学意义(P<0.01)；各时间点各组24 h尿蛋白水平均较正常组显著增高，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表1 各组血液生化指标比较

与模型组比较:1)P<0.01；与泼尼松组比较:2)P<0.01

表2 各组实验第2、4、6、8周24 h尿蛋白水平

与模型组比较：1)P<0.01；与泼尼松组比较：2)P<0.01；与正常组比较：3)P<0.01

2.3各组实验第2、8周24 h尿β2-MG、ALB、IgG排出情况 第2周，各组24 h尿β2-MG、ALB、IgG排出量差异无统计学意义(P>0.05)。第8周，与模型组比较，正常组β2-MG、IgG、ALB排出量，中药组及泼尼松组IgG、ALB排出量均明显低于模型组(均P<0.01)，中药组IgG，模型组IgG、ALB排出量均明显高于泼尼松组(均P<0.01)。见表3。

表3 各组实验第2、8周β2-MG、ALB、IgG排出情况

2.4肾脏病理变化 光镜下除正常组外各实验组均有不同程度肾小球肥大，肾小球毛细血管壁增厚，系膜增生，蛋白渗出及新月体形成，肾小管管腔扩张，上皮细胞坏死脱落，肾小管腔内有蛋白管型，间质细胞浸润，动脉壁增厚等变化，见图1。PAM-Masson染色基膜上皮侧可见三色染色呈红色的蛋白样物质沉积及嗜银的钉突形成，其中模型组变化最大。家兔肾小球直径中药组为(133.25±36.78)μm，泼尼松组(123.71±26.16)μm，模型组(169.38±32.20)μm，正常组(88.80±23.12)μm。模型组与治疗组比较差异有统计学意义(P<0.01)。中药组与泼尼松组无显著差异(P>0.05)。

电镜下正常家兔基底膜外疏松层阴离子位点呈高密度，颗粒较大，且规则分布，内疏松层低密度不规则分布，上皮细胞表面未发现PEI染色颗粒。模型组阴离子位点显著减少，颗粒小。两治疗组阴离子位点部分呈单层，部分双层，颗粒大小也与正常组近似，部分足突完整。见图2。

图1 各组肾脏病理变化(HE，×400)

3 讨 论

本实验结果表明小柴胡汤和泼尼松均能减少尿ALB、尿IgG排出，可减少24 h尿蛋白排出，提高血ALB，纠正脂质代谢紊乱，其中泼尼松组无明显降血脂作用。两种药均能减少基底膜电荷丢失，表明两组均能对肾小球的电荷屏障和分子屏障起到一定的保护作用。本文中药组家兔在改善一般状态如进食、体重变化及提高血ALB、减少尿蛋白、降血脂等方面明显优于泼尼松组，但后者在尿IgG排出明显少于中药组，推测泼尼松组在保护肾小球分子筛屏障方面优于中药组。对实验家兔形态学上比较发现，中药组和泼尼松组肾小球直径与模型组相比有显著差异，表明两组药物均能减轻肾小球肥大，泼尼松组更优于中药组。本实验西药的治疗效果得到了验证，但其副作用也明确体现出来，表明中药复方对MN有一定治疗效果，同时在改善全身一般状态及减少副作用上优于西药。

本中药复方系小柴胡汤加黄芪、灵芝、绞股蓝、减半夏组成。近年来国内外学者对小柴胡汤的药理作用进行了广泛深入地研究，发现其具有糖皮质激素样作用，具有增强机体免疫功能，进一步改善肾功能的作用〔6～9〕。MN是免疫性疾病同时其血栓和栓塞并发症的发病率是肾病综合征多种病理类型之冠。故我们在小柴胡汤基础上增加了黄芪、灵芝、绞股蓝增加其免疫调节和降血脂作用〔10～19〕，观察该方对MN治疗效果。实验得到了我们预想结果，不仅明显减少了免疫复合物形成和沉积而且具有明显升高血ALB和降血脂作用，同时对GBM电荷屏障、分子筛屏障起一定的保护和修复作用。这种作用是该中药降低肾病家兔尿蛋白的主要原因。推测该药能中和血液中阳离子因子，阻止其对GBM阴电荷的破坏。现代医学认为免疫功能紊乱、脂质代谢紊乱、脂质过氧化、自由基和肾小球内凝血是肾炎发生、发展的重要因素。中药复方可能亦通过影响这些因素治疗、延缓MN进展。

综合分析本文资料，说明中药复方治疗MN效果确切。它能抑制和减少免疫复合物形成并清除肾小球上皮下沉积的IC，减轻肾小球滤过膜损害，促进GBM屏障的恢复，减少蛋白尿，其作用机制是多个方面的。本研究为这一中药治疗肾炎提供了实验依据。