血浆外泌体miR-29c在血管性认知障碍患者中的表达及意义

赵维纳 孙文强 贺梦菲 谭琳 尹昌浩 孙丽 王加良

(1牡丹江医学院附属红旗医院神经内科，黑龙江 牡丹江 157000；2牡丹江医学院；3牡丹江医学院附属红旗医院药学部)

随着我国人口老龄化的加快，血管性认知障碍(VCI)的发病率逐年升高，尤其是血管性痴呆已占全部痴呆人群的36%，VCI包括从轻度认知功能受损到痴呆的各种程度的认知功能障碍〔1〕。轻度认知功能受损症状较轻，易忽视，但发展至中晚期的治疗效果不甚理想，极大增加治疗的困难性，严重影响老年人的生存质量和身心健康，因此，VCI的早期诊断和干预对VCI 治疗具有积极的临床意义〔2〕。miRNA是一类参与机体发育、基因转录调节、神经突触形成、细胞增殖、分化和凋亡过程中的非编码单链核酸小分子〔3〕。miR-29家族与缺血或缺氧引发的炎症反应相关的VCI发生、发展有重要关系〔4〕，但血浆外泌体miR-29c在VCI中的表达和作用尚不明确，本研究拟探讨血浆外泌体miR-29c在VCI患者中的表达水平及临床意义。

1 资料与方法

1.1基础资料 经医院伦理委员会批准，牡丹江医学院附属红旗医院2018年3～8月收治的68例VCI患者为观察组，另选取65例健康志愿者为健康组，观察组男38例，女30例；年龄55～77岁，平均(63.27±7.54)岁；VCI非痴呆35例，血管性痴呆11例，混合型痴呆22例；受教育年限6～16年，平均(10.75±1.84)年。健康组男34例，女31例，年龄54～75岁，平均(62.73±7.21)岁；受教育年限5～16年，平均(11.26±1.96)年。两组基础资料差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：①观察组符合《血管性认知障碍诊治指南》VCI诊断标准〔5〕，影像学检查结果显示存在脑血管病变灶，且存在认知障碍；②均签署知情同意书。排除标准：①甲减、梅毒性血管炎、维生素(Vit)B12缺乏所致的认知障碍者；②存在精神障碍者；③合并严重代谢性疾病、恶性肿瘤者；④严重视听和语言障碍者。

1.2研究方法 (1)采用实时荧光定量聚合链式反应(qRT-PCR)检测两组血浆外泌体miR-29c的表达水平：①采集所有研究对象血液样本，1 500 r/min离心5 min，收集血浆；②外泌体提取试剂盒(Norgen Biotek公司)提取外泌体；③外泌体RNA提取试剂盒(Norgen Biotek公司)提取和纯化外泌体小RNA；④反转录得到cDNA，利用qRT-PCR仪(瑞士Roche，型号：cobas z480)进行扩增，引物合成(上海生工)，上游引物：5'-CCAGCGTGTAGCACCATTT-3'，下游引物：5'-AGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'，反应条件：95℃，30 min；95℃，25 s；63℃，30 s；72℃，25 s；35个循环，AceQqPCRSYBR®GreenMix(南京vazyme，货号：Q221-01)，以U6为内参。采用2-ΔΔCt法定量分析血浆外泌体miR-29c表达水平。

(2)采用蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评价两组认知功能，包括注意(3分)、语言(5分)、执行(3分)、记忆(6分)、视结构技能(4分)、计算力(3分)和地点定向力(6分)，评分0～30分，分值越高，表示患者认知功能越良好。

(3)于清晨空腹抽取肘部血液5 ml，3 000 r/min离心10 min，收集血清，通过酶联免疫吸附试验检测同型半胱氨酸(Hcy)、C反应蛋白(CRP)、叶酸(FA)、VitB12，最后酶标仪(美国Bio-Rad，型号：680)上样检测并分析血浆外泌体miR-29c表达量与MoCA评分、血清中Hcy、CRP、FA和VitB12水平的相关性。

1.3统计学分析 采用SPSS25.0软件进行t检验、Pearson相关分析。

2 结 果

2.1两组血浆外泌体miR-29c水平 观察组血浆外泌体miR-29c表达水平(4.64±0.33)显著高于健康组(2.72±0.15，t=42.861,P=0.000)。

2.2两组认知功能评分比较 观察组MoCA总评分及注意、语言、执行、记忆、计算力、定向力、视结构技能评分均显著低于健康组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.3两组VCI指标比较 观察组Hcy、CRP水平显著高于健康组(P<0.05)，FA和VitB12水平显著低于健康组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.4观察组血浆外泌体miR-29c表达量与VCI指标的相关性 血浆外泌体miR-29c表达量与MoCA评分、FA、VitB12水平均呈负相关(r=-0.705、-0.718、-0.815，P=0.001、0.000、0.000)，与Hcy、CRP水平呈正相关(r=0.724、0.729，均P=0.000)。

表1 两组MoCA评分比较分)

表2 两组Hcy、CRP、FA和VitB12水平比较

3 讨 论

VCI是老年人常见的进展性认知损害，是由脑血管病或存在的脑血管危险因素引起的一类获得性认知障碍综合征，非痴呆型VCI患者的认知损伤是局灶性的症状较轻，不易引起警觉，进而发展为痴呆，严重危害老年人的身心健康，目前临床上尚未找到有效的治疗手段〔6〕。miRNAs是一类长度20～24个核苷酸的非编码单链RNA，血浆外泌体中富集大量miRNA，具有较强抗降解能力，miRNA的表达水平也可反映机体的生理和功能状态，可作为疾病诊断的新型生物学标志〔7〕。血浆外泌体源性miRNA与认知功能障碍有关，研究发现血浆外泌体miR-422a在脑卒中发病早期的患者中表达水平显著升高；miR-29c表达量与心血管疾病危险因素(糖尿病等)的发生发展也存在密切关系〔8，9〕，但在VCI患者中的应用尚不清楚。

本研究结果说明VCI患者血浆外泌体中miR-29c表达水平升高，提示miR-29c与认知功能障碍相关；VCI降低了患者注意、集中、语言、记忆和空间想象等认知能力，致使认知功能损伤。另外，VCI患者血清中Hcy、CRP水平升高，FA和VitB12水平降低。miR-29c是从神经细胞核糖和核蛋白中发现并克隆出miR-29家族，位于人类的1号染色体上，具有调控人体生物学功能的作用，如细胞增殖、分化和凋亡等〔10〕。刘辰庚等〔11〕发现miR-29c在阿尔茨海默病患者血浆外泌体中表达量显著降低，可用于阿尔茨海默病早期诊断的候选生物标志物。与本研究结果相符，推测miR-29c可作为VCI疾病治疗的作用靶点。Hcy是甲硫氨酸经脱甲基后脱苷得到的一类含硫氨基酸，血清中Hcy高水平会损伤血管内皮细胞，是引发脑血管疾病的危险因素，脑血管病会造成VCI，促进痴呆发展。CRP是炎症发生时的急性炎性蛋白，血清中CRP水平与脑动脉粥样硬化密切相关〔12〕。Zhang等〔13〕研究证实血管性痴呆患者血清中Hcy、CRP显著高于正常人体水平，且与血管性痴呆的严重程度呈显著相关性，是致使VCI的重要危险因子，与本研究结果一致。FA具有保护血管的作用，通过促进合成四氢生物喋呤，加快一氧化氮(NO)的合成和利用，增强血管舒张；VitB12是甲基四氢叶酸转甲基酶的辅酶，FA和VitB12是Hcy代谢的重要辅助因子〔14〕。此外，本研究结果说明血浆外泌体miR-29c表达量越高，MoCA评分越低，FA、VitB12水平越低，Hcy、CRP水平越高，认知功能损伤越严重，提示血浆外泌体miR-29c表达水平与VCI危险因子及脑血管疾病引起的认知功能障碍密切相关。叶蓓等〔15〕发现miR-29c低表达能够减轻大鼠脑缺血再灌注神经损伤，具有明显的神经保护功能，miR-29c表达升高，抑制神经细胞迁移，损伤神经功能，造成认知功能障碍。VCI血浆外泌体miR-29c表达升高和血清Hcy、CRP、FA、VitB12水平异常，均会造成认知功能障碍，两者存在显著相关性。因此，miR-29c具有作为VCI诊断候选生物标志物的潜能。