Nrf2/HO-1通路介导的及己根与雷公藤水提取物致大鼠心脏毒性的比较研究

杜云艳，孙淑萍，殷传刘，锁孝国，王 洋，朱恩泽

中药在治疗疾病方面具有良好的抗炎、免疫抑制等生物活性，用于治疗类风湿性关节炎时具有多成分、多环节以及多靶点的特点［1-3］.近年来，中药的使用越来越广泛，由于中药成分复杂多样，在发挥其疗效的同时可能会引起机体各个器官的损伤.而不同器官的自由基排毒水平不同，心脏相比于其他器官其自由基排毒水平较低［4］，导致心脏组织对氧化应激损伤具有高敏感性.

中药雷公藤及其制剂因具有糖皮质激素样抗炎、免疫抑制作用，且无糖皮质激素的副作用，因此广泛用于治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病.但在治疗疾病的过程中，雷公藤引起的毒副反应严重，发生率高，中毒事件屡见报道［5］.李慧等研究证实，雷公藤提取物在一定的剂量范围内对大鼠心脏有明显毒性作用［6］，可见心脏毒性是其主要的毒副作用之一.由于其毒性反应严重，因此有必要进一步寻找毒性小且作用明显的替代中药用于抗类风湿性关节炎的治疗.

及己为金粟兰科金粟兰属植物，广泛用于治疗腰腿痛、风湿及类风湿性关节炎等炎性疾病.已有研究表明，及己根水分离部位能够明显抑制脂多糖诱导的巨噬细胞的损伤［7］.但《中药大辞典》记载“及己是有毒的中药”［8］.它能够引起机体多系统的功能损伤，曾有服用过量及己中毒的案例.尸检显示，心脏表面有大量出血点，心脏病理组织可见灶性炎细胞浸润，心肌酶谱异常升高［9］.课题组前期也发现及己地上部分醇提物能够诱导大鼠心脏毒性，高剂量作用下的大鼠出现心肌纤维解体紊乱、间隙明显增宽，且观察到脂肪变态反应及嗜酸性变［10］.由此可见，及己对心脏也有损伤作用.

雷公藤和及己根可用于治疗类风湿性关节炎，但均对心脏有一定的毒副作用.目前尚未见有关及己根与雷公藤水提取物致心脏毒性大小的比较研究.鉴于水煎煮法提取中药是中药入药的主要方式，因此，本研究拟通过对及己根与雷公藤水提取物的心脏毒性大小进行比较，并初步探索其毒性机制，从而探讨二者抗炎功效是否有进一步研究开发的价值.

1 材料与仪器

1.1 实验药材

及己根、雷公藤购自亳州药材市场，参照《中药大辞典》，经皖南医学院朱建华教授鉴定为真品.将及己根、雷公藤洗净，自然风干后粉碎成粗粉，室温干燥保存.

1.2 实验动物

鼠龄为6 周的SD 雄性大鼠，体重200±10 g，购自山东省实验动物中心，批准文号：SCXK（鲁）2014-0007，健康状况良好.将大鼠饲养在25±1 ℃、通风良好的动物房内，正常给予饮食、饮水，每天光照12 h，适应性喂养7 天后开始实验.本实验中所有动物实验均根据《实验动物的护理和使用指南》进行，且使用的所有实验程序均已获得皖南医学院药学院伦理委员会批准（WNMC No.20190609）.

1.3 仪器

高速冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）；Tp1020-1 全自动组织脱水机（上海徕卡显微系统贸易有限公司）；全自动生化分析仪（深圳市库贝尔生物科技有限公司）；Amersham Imager 600自动曝光仪（General Electric Company）；Biorad电泳仪（深圳市宇德立生物科技有限公司）；CKX31 OLYMPUS 显微镜（昆山诺普森实验室用品科技有限公司）等.

1.4 试剂

肌酸激酶（CK）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、丙二醛（MDA）、乳酸脱氢酶（LDH）、谷草转氨酶（AST）、α-羟基丁酸脱氢酶（α-HBDH）、蛋白浓度测定试剂盒（南京建成科技有限公司）；小鼠核因子E2 相关因子-2（Nrf2）抗体（Proteintech Group）；Rabbit Anti-HO-1、Mouse Anti-β-Actin、Goat Anti-Mouse IgG、Goat Anti-Rabbit IgG、Mouse Anti-ICAM-1、免疫组化三步法试剂盒（博士德生物工程有限公司）；BeyoECL plus 化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；硝酸纤维素（NC）膜（Pall Corporation）等.

2 方法

2.1 及己根、雷公藤水提取物的制备

定量称取及己根粗粉400 g，分别回流提取三次：第一次加18 倍量水，浸泡1 h，提取2 h；第二次加15 倍量水，提取1.5 h；第三次加12 倍量水，提取1 h，合并抽滤后的滤液，减压浓缩至粘稠状，并在真空干燥箱中干燥，然后粉碎过100目药筛，得到及己根水提取物（GS）.雷公藤水提取物（LS）制备方法同上.提取率（%）=水提取物重量/药材粗粉重量×100%.GS 提取率为14.0%，LS提取率为11.2%.

2.2 动物分组与给药

将生长状况良好的30 只SD 雄性大鼠随机均分为空白（KB）组、GS 组、LS 组.根据预实验结果和种属间等效剂量折算表［11］，确定大鼠日给药量（提取物质量，g/kg）为：成人临床用药剂量3 g（原药材）×换算系数（0.018）×药材提取率（GS 提取率为14.0%，LS提取率为11.2%）×倍数（100）×5；5为200 g大鼠用药量转化成1 kg大鼠用药量，即GS组为3.78 g/kg、LS组为3.02 g/kg.GS组与LS组大鼠分别灌胃给予蒸馏水溶解的及己根与雷公藤水提取物溶液，KB组给予等量蒸馏水，每天灌胃1次，连续灌胃14天.

2.3 急性毒性实验

在实验开始前，按照GS 组37.8 g/kg、LS 组30.2 g/kg 的剂量分别向大鼠灌胃给予相应浓度提取物.如果未观察到死亡率，则另外选取2只动物灌胃给予GS 溶液，2 只动物给予LS 溶液，在48 h内观察这些动物的总体形态变化和死亡率.

2.4 大鼠一般情况观察

在给药期间，观察大鼠的饮食、饮水、活动、精神等一般情况.从给药之日起，隔天对各组大鼠进行称重，并计算体重变化率.

2.5 标本的采集

于第15天，按剂量0.3 mL/100 g腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，用毛细管从眶后内侧静脉丛收集大鼠的血样.将血液于4 ℃、4 500 r/min条件下离心10 min，取上清液即为血清，-80 ℃保存.随后将仍在麻醉状态下的大鼠颈椎脱臼处死，迅速摘取心脏，用预冷的PBS缓冲液清洗，待滤纸吸干表面水分后，使用分析天平称重并计算脏器指数.脏器指数（%）=脏器质量（g）/大鼠质量（g）×100%.取适量组织用10%甲醛固定，用于病理组织学检查，剩余部分放入-80 ℃冰箱保存.

2.6 心脏匀浆生化指标MDA、T-SOD 的含量测定

取适量-80 ℃冰箱保存的心脏组织，按1∶9（重量/g∶体积/mL）的比例加入生理盐水，在冰水浴中匀浆，并将匀浆液于4 ℃、3 000 r/min条件下离心15 min，取上清液，按照试剂盒说明书测定心脏组织匀浆中MDA、T-SOD含量.

2.7 血清中CK、CK-MB、LDH、AST和α-HBDH的含量测定

将-80 ℃保存的血清，室温条件下复温，按照试剂盒说明书测定血清中CK、CK-MB、LDH、AST和α-HBDH含量.

2.8 心脏组织形态病理学观察

将10%甲醛固定的心脏组织按大小为1.5×1.0 cm、厚度0.2 cm 取材，进行常规脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡并复水，然后将切片用苏木精和曙红（H＆E）染色、脱水、透明、封片，并由两名病理学家在光学显微镜下观察以鉴定是否存在炎性细胞浸润、血管扩张充血和脂肪变性等病理学改变.

2.9 Western blot 检测大鼠心脏中HO-1、Nrf2蛋白表达情况

取适量组织，加入200 μL裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）于冰上裂解20 min，在4 ℃、12 000 r/min 条件下离心10 min，取上清液，使用考马斯亮兰蛋白浓度测定试剂盒测定心脏总蛋白浓度，后加入上样缓冲液煮沸变性10 min.按照每孔30 μg蛋白量上样，分别用12%、10%分离胶进行电泳，110 V 恒压转膜.将NC 膜用5%脱脂牛奶溶液封闭2 h 后，并在4 ℃孵育β-actin、HO-1、Nrf2 一抗过夜，再孵育二抗，滴加化学发光液曝光显影.用Image J 软件读取灰度值，分别计算HO-1、Nrf2与β-actin的灰度值比值，并进行统计分析.

2.10 免疫组化法检测大鼠心脏中黏附因子ICAM-1的表达

将2.8 步骤制作的切片烤片，脱蜡，复水，并在柠檬酸钠缓冲液中孵育以进行抗原热修复.将切片用过氧化氢处理以淬灭内源性过氧化物酶，并用血清封闭30 min后与ICAM-1一抗在4 ℃孵育过夜，滴加二抗37 ℃恒温孵育1 h.然后，滴加SABC 试剂并37 ℃恒温孵育1 h，用DBA 处理并用苏木精复染.将切片进行盐酸酒精分化，氨水返蓝，脱水，透明，封片等一系列操作后，在光学显微镜下观察并拍照.用Image J软件统计阳性表达百分率并进行统计分析.

2.11 统计学分析

用SPSS17.0 进行数据处理，结果用平均值±标准差（-x±s）表示，多个样本均数间的比较采用方差分析，LSD 用于事后检验.p＜0.05 表示差异具有显著统计学意义，p＜0.01 表示差异具有极显著统计学意义.

3 结果

3.1 急性毒性实验结果

在GS 和LS 的灌胃剂量分别高达37.8 g/kg和30.2 g/kg时，GS和LS不会引起大鼠死亡现象.此外，还发现GS 和LS 的LD50分别高于37.8 g/kg和30.2 g/kg.因此，最终选择GS 37.8 g/kg 和LS 30.2 g/kg 作为评估GS、LS 诱发的大鼠心脏毒性大小的剂量.

3.2 各组大鼠一般情况

KB 组大鼠饮食、饮水、大小便正常，精神状况良好，皮毛光滑有光泽；GS 组大鼠状态与KB组相似，未见明显异常；LS 组大鼠饮食减少，行动迟缓，精神萎靡，反应迟钝，大便呈糊状，皮毛粗糙无光泽，部分大鼠有嘴角出血的情况，且在灌胃第3天、10天、13天各有一只大鼠死亡，死亡时有明显的角弓反张现象.

3.3 各组大鼠体重

从第5 天到第15 天，KB 组大鼠体重增长最快，其次是GS 组.与KB 组比较，GS 组从第11 天开始体重增长明显减慢（p＜0.01）；LS 组从第9天开始体重增长明显减慢（p＜0.01），在实验后期甚至出现负增长.与GS 组相比，LS 组从第11天开始体重增长率明显降低（p＜0.01），见图1.

图1 不同组大鼠体重变化率曲线

3.4 各组大鼠心脏脏器指数

与KB 组相比，GS 与LS 均使大鼠心脏脏器指数升高.不同的是，GS 组大鼠心脏脏器指数上升不具有显著性（p＞0.05），而LS组大鼠心脏脏器指数极显著性上升（p＜0.01），见图2.

图2 各组大鼠心脏脏器指数比较

3.5 各组大鼠心脏匀浆中MDA、T-SOD含量

与KB 组相比，GS 组、LS 组大鼠心脏匀浆中的MDA含量均升高，T-SOD含量均降低.且GS组MDA、T-SOD含量的变化没有显著性（p＞0.05），而LS 组MDA 含量的升高和T-SOD 含量的降低均具有极显著性（p＜0.01），见图3.

图3 各组大鼠心脏匀浆中MDA、T-SOD的含量

表1 各组大鼠血清中CK、CK-MB、LDH、AST和α-HBDH的含量（-x±s） μ/L

3.6 各组大鼠血清中CK、CK-MB、LDH、AST和α-HBDH含量

与KB 组相比，LS 组CK-MB、LDH、AST 和α-HBDH含量均极显著性升高（p＜0.01），CK含量显著性升高（p＜0.05）；而GS 组CK、CK-MB、LDH和α-HBDH含量虽均升高，但其变化均无显著性差异（p＞0.05），AST 含量甚至出现降低（p＞0.05），见表1.

3.7 各组大鼠心脏组织形态

组织病理学结果显示，KB 组大鼠心肌纤维排列整齐，心肌纹理清晰，染色均匀，细胞核与细胞质分明，未见明显病变；GS组心肌纤维间有少量出血，心肌纤维轻度紊乱，伴随少量炎性细胞浸润；LS组心肌纤维间出血，心肌纤维紊乱较GS组严重，并观察到血管明显扩张充血，少量脂肪变性和部分细胞核固缩现象，见图4.

图4 及己根与雷公藤水提取物对大鼠心脏组织形态的影响（100×）

3.8 各组大鼠心脏HO-1、Nrf2蛋白表达水平

与KB 组相比，GS 组、LS 组大鼠心脏组织中HO-1、Nrf2 蛋白的表达均明显降低（p＜0.05 或p＜0.01）.且与GS 组相比，LS 组大鼠心脏组织中HO-1、Nrf2 蛋白表达的降低也均具有极显著性（p＜0.01），见图5.

图5 各组大鼠心脏组织HO-1、Nrf2蛋白表达情况

3.9 各组大鼠心脏组织ICAM-1表达

ICAM-1 的阳性表达为胞质呈棕黄色颗粒，颜色越深即表达越强.从免疫组化结果图能看到，LS 组胞质棕黄色较深，其次是GS 组.统计分析的结果与免疫组化结果图一致，与KB组相比，GS组与LS组ICAM-1阳性表达率均极显著性升高（p＜0.01），且LS 组ICAM-1 的阳性表达率较GS组极显著性升高（p＜0.01），见图6.

图6 各组大鼠心脏组织ICAM-1表达情况（200×）

4 讨论

心脏毒性作为药物临床试验前必须严肃考量的指标，在部分疗效确切的药物中也存在一定的隐患［12］.中药及己和雷公藤皆能祛风除湿，活血通络等，在治疗炎症方面具有较好的疗效.但文献记载，雷公藤的主要成分雷公藤红素和及己的根、茎、叶醇提物均可致心脏毒性［13］.值得一提的是，及己根所致心脏毒性相比于茎、叶并不明显［14］.因此，中药及己根和雷公藤谁能作为新型抗炎药物更胜一筹仍需进一步研究.

体重变化率和脏器指数是毒理实验中常用的指标［15］.在本研究中，给药后LS 组大鼠的体重增长率和脏器指数的变化均比GS组明显.同时，HE染色结果也显示，LS组较GS组心肌纤维排列紊乱，出血淤血严重.这些均表明LS造成了较GS更严重的心脏损伤.

氧化应激是各种因素刺激致机体组织或细胞内自由基生成和抗氧化防御间的严重失衡，造成活性氧簇（ROS）在机体或细胞内蓄积而引起细胞毒性反应，出现组织损伤的过程［16］.当机体受刺激时，过量ROS 激增会攻击细胞膜、核膜等生物膜，引起脂质过氧化，形成脂质过氧化产物如MDA 等［17］.MDA 作为脂质过氧化的最终产物之一，可引起蛋白质、核酸等其他活性大分子的交联聚合反应，加剧膜损伤和细胞毒性，其含量的高低反映了氧化应激程度［18］.SOD酶作为一种重要的抗氧化酶，可防御氧化应激介导的组织损伤，其含量减少可导致氧化应激程度加大［19］.与上述研究结果一致，本实验中LS组MDA含量显著升高，T-SOD含量显著降低，而GS组这两个指标均无明显变化，说明LS 组大鼠出现了严重的氧化应激损伤.

脂质过氧化会破坏细胞膜的完整性，增加细胞膜通透性，释放CK、CK-MB、LDH、AST 及α-HBDH 等心肌酶进入血液［19］.其中，LDH 的高低反映心肌受损程度，LDH 含量越高，心肌受损越严重；CK-MB在心肌细胞中含量最高，对判断心肌损伤程度具有高度特异性，被认为是诊断心肌损伤的标准诊断参数［20］；α-HBDH 主要来源于心肌，常被用来反映心肌的氧化应激状态［21］，故检测此五个指标可反映心肌损伤的严重程度.本研究中LS组CK、CK-MB、LDH、AST和α-HBDH含量较GS 组及KB 组的显著性升高，表明LS 组大鼠心脏损伤较严重.

在调节机体免疫反应中，ICAM-1 能通过介导细胞黏附、趋化等过程，即在内皮细胞和免疫细胞表面表达，促进细胞间粘附，进而促进氧自由基的释放和内皮细胞的破坏，参与炎症性血管疾病，故其含量高低可反映氧化应激水平的高低［22］.与以上血液生化指标结果一致，LS 可使ICAM-1阳性表达明显增强，说明LS组氧化应激程度严重.

Nrf2/HO-1 通路是内源性和外源性氧化应激反应的主要调控因子.正常状态下，胞浆内Nrf2与细胞骨架相关性抑制蛋白（Keap1）结合形成复合体，诱导其经泛素蛋白酶途径降解.在病理生理条件下产生的ROS 可刺激机体产生免疫应答，引起Nrf2 与Keap1 解离入核，与抗氧化反应元件结合，进而促进抗氧化物如SOD、保护蛋白质HO-1 等的产生来抵抗机体的氧化损伤［23］.研究表明，毒性药物能够加重氧化应激和心肌损伤的程度，并抑制Nrf2 通路的激活［24］，减少下游产物HO-1蛋白的表达，从而引起机体损伤［25］.本研究发现，与GS 组及KB 组相比，LS 组HO-1、Nrf2 蛋白表达均极显著性降低，说明LS组心脏毒性较大.

综上所述，LS 能够导致更严重的大鼠心脏毒性，其机制可能与氧化应激及Nrf2/HO-1通路的抑制有关，这也表明及己根作为抗炎药物有进一步研究开发的价值.