胰腺癌组织c-MET表达与循环miR-34a、miR-449水平的相关性

何春华 董来荣 沈亦钰 王晓光

嘉兴医学院附属第二医院普外科，嘉兴 314000

微小RNA(microRNA, miRNA)在肿瘤疾病诊治中的价值受到越来越多的重视。由于miRNA具有表达时序性和组织特异性，外周血中的含量在疾病发展的某一阶段亦相对稳定，因此miRNA是一种颇具潜力的肿瘤标志物[1-2]。间质表皮转化因子(c-mesenchymal epithelial transition factor, c-MET)是原癌基因MET编码的蛋白，是胰腺癌重要的预后因子，高水平的c-MET往往提示患者预后不良[3-4]。有研究发现，c-MET存在miR-34a和miR-449结合位点，且这两个miRNA都是公认的抑癌基因[5]。本研究旨在探讨胰腺癌组织c-MET的表达与循环miR-34a和miR-449水平的相关性，为胰腺癌的诊治靶点提供理论依据。

资料与方法

一、一般资料

收集2015年3月至2017年3月间嘉兴医学院附属第二医院普外科行手术治疗的41例胰腺癌患者的临床资料，其中男性23例，女性18例；年龄43～75岁，中位年龄63岁，平均年龄64岁。纳入标准：(1)手术病理证实为胰腺导管腺癌；(2)保存手术切除的胰腺癌组织及其匹配的经病理证实的癌旁正常胰腺组织；(3)保存手术前和手术后3个月首次复查的肝素抗凝的全血样本；(4)临床资料和随访资料完整。排除标准：(1)手术前有放化疗和免疫靶向治疗等其他疗法干预史；(2)术后随访时间不足2年；(3)随访期内发生其他恶性肿瘤者；(4)合并糖尿病或传染病者。记录患者的年龄、性别、体重指数(body mass index, BMI)及肿瘤部位、大小、分化程度、临床分期、淋巴结转移、远处转移情况等。所有患者完成>2年的随访，统计病死率。

二、胰腺癌组织c-MET表达检测

取甲醛固定的胰腺癌及癌旁正常胰腺组织，常规石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色，由病理科医师阅片。另取石蜡切片，采用免疫组织化学法检测组织c-MET表达。兔抗人c-MET一抗(ab252205，Abcam)工作浓度1∶50，山羊抗兔二抗(ab205718，Abcam)工作浓度1∶2 000，最后DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，中性树胶封固。由病理科医师阅片，胞质或胞膜出现棕黄色颗粒为c-MET阳性，依据阳性细胞所占比例(1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分)及染色强度(无染色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，深黄色为3分，黄褐色为4分)进行评分，两分相加≥4分为c-MET阳性。

三、循环miR-34a、miR-449提取及检测

取术前未经抗肿瘤治疗及术后3个月首次复查时的空腹肘静脉血，加入肝素抗凝的试管，混均后置-80℃无菌存储。应用miRNA快速提取试剂盒提取和纯化循环miRs，采用荧光定量PCR法测定循环miR-34a、miR-449水平。先逆转录生成 cDNA，再应用荧光定量PCR扩增试剂盒扩增生成miR-34a或miR-449，严格按照试剂盒说明书操作。 miR-34a、miR-449及内参U6引物序列见表1，引物由上海生工生物技术工程股份有限公司设计并合成。PCR反应程序：95℃ 60 s，95℃ 30 s、60℃ 30 s、2℃ 30 s，40个循环。由仪器自带软件获取Ct值，根据公式2-△△Ct计算miR的表达量。

四、统计学处理

表1 靶向 miR-34a、miR-449、U6的引物序列

结 果

一、胰腺癌组织c-MET表达及其与患者临床病理参数的关系

胰腺癌组织c-MET阳性表达率为63.4%(26/41)，癌旁正常胰腺组织的c-MET阳性表达率为24.4%(10/41)，胰腺癌组织明显高于癌旁正常胰腺组织，差异有统计学意义(χ2=12.676，P=0.000)。胰腺癌组织c-MET阳性表达与患者年龄、性别、BMI及肿瘤部位、分化程度均无相关性，但与TNM分期及淋巴结转移相关，即c-MET阳性患者TNM Ⅲ/Ⅳ期、淋巴结转移率均明显高于c-MET阴性患者，差异均有统计学意义(表2)。

二、胰腺癌组织c-MET表达与患者预后的关系

c-MET阳性与c-MET阴性患者的生存率分别为38.5%和53.3%，中位生存期分别为29.5个月和35.0个月；无进展生存率分别为19.2%和40.0%，无进展中位生存期分别为24个月和33个月。c-MET阳性患者的生存率及无进展累积生存率均较c-MET阴性患者明显缩短，病死率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

三、胰腺癌组织c-MET表达与循环miR-34a、miR-449水平的关系

术前c-MET阳性患者循环miR-34a与miR-449水平较c-MET阴性患者低，差异有统计学意义；术后两组患者循环miR-34a水平的差异无统计学意义，但c-MET阳性患者miR-449水平低于c-MET阴性患者，差异有统计学意义(表3)。

四、术前循环miR-34a、miR-449水平对胰腺癌TNM分期、淋巴结转移和预后的预测价值

术前循环miR-34a、miR-449水平对胰腺癌淋巴结转移、TNM Ⅲ/Ⅳ期及预后均有较好的预测价值(图2，表4)。

表2 胰腺癌组织c-MET表达与患者临床病理参数的关系

注：c-MET为间质表皮转化因子；BMI为体重指数

注：c-MET为间质表皮转化因子

图1c-MET阳性与阴性的胰腺癌患者生存曲线(1A)和无进展生存曲线(1B)

表3 胰腺癌组织c-MET阳性与阴性患者手术前后循环miR-34a、miR-449水平的比较

注：c-MET为间质表皮转化因子

图2 循环miR-34a、miR-449水平预测肿瘤Ⅲ/Ⅳ期(2A)、淋巴结转移(2B)及随访期患者死亡(2C)的ROC曲线

表4 循环miR-34a、miR-449水平预测胰腺癌病情和预后的ROC曲线分析

讨 论

miRNA不具有蛋白翻译功能，主要依靠锚定mRNA来发挥生物学活性，与抑癌基因结合可发挥促癌作用，与原癌基因结合可发挥抑癌作用。Li等[6]报道，miR-155-5p靶向结合肿瘤蛋白p53诱导核蛋白1抑制宫颈癌细胞转移。Yan等[7]报道，miR-629靶向结合FOXO3促进胰腺癌进展。张宏伟和王彩茹[8]报道，miR-222靶向调控PTEN表达抑制胰腺癌细胞的侵袭迁移能力。吴翔等[9]报道，胰腺导管腺癌miR-21与TGF-β1信号通路相关。

文献报道，RNA结合蛋白STAT3能促进肺癌细胞生成miR-34a，使细胞周期停滞在G期[10]；miR-34a可调控酪氨酸激酶受体2，抑制癌细胞的耐药[11]；SNHG7通过调节miR-34a-Snail-EMT信号通路，进而抑制胃癌细胞的迁移与侵袭能力[12]；miR-449a靶向调节c-MET抑制Hela细胞的迁移及侵袭能力[13]。这些研究结果支持miR-34a、miR-449具有抑癌作用。

c-MET能够特异性与肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)结合，参与多种肿瘤性疾病的发生与发展[14-15]。王玲[16]从多个数据库(Oncomine、cBioportal、GEPIA等)收集胰腺癌c-MET表达的有关论文，证实c-MET在胰腺癌组织显著高表达。c-MET抑制剂用于抑制胰腺癌细胞增殖的基础研究也已取得了一定的进展[17]，表明c-MET是一种原癌基因，促进肿瘤的发生与发展。

本研究结果显示，胰腺癌组织c-MET蛋白表达明显高于癌旁正常胰腺组织，c-MET阳性患者的TNM分期以Ⅲ/Ⅳ期居多，淋巴结转移率更高，生存时间更短，病死率更高，与文献报道基本一致[18]。进一步分析发现，治疗前c-MET阳性患者的循环miR-34a、miR-449水平明显低于c-MET阴性患者，手术后循环miR-34a、miR-449水平均明显回升，术前循环miR-34a、miR-449水平对胰腺癌淋巴结转移、TNM Ⅲ/Ⅳ期及预后有较好的预测价值，均提示c-MET与miR-34a、miR-449之间存在负反馈调节作用。c-MET可作为潜在的肿瘤标志物展开深入研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突