产吲哚乙酸（IAA）促生菌的分离鉴定及对烟草种子萌发和幼苗生长发育的影响

陈 越 李虎林 朱诗苗 闫 寒 郎 彬 姬文秀

（延边大学农学院，133002，吉林延吉）

吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）是植物生长素的一种，是植物生长过程中分泌的调节植物生长的信号物质[1]，能促进细胞生长，使细胞的体积和质量增加，还具有促进细胞分裂和分化、调节生根等生理功能[2]。研究发现，在土壤中约有一半的细菌能够合成IAA[3]，而这些细菌常见于植物根际促生菌（plant growth-promoting rhizabacteria，PGPR）。PGPR泛指生存于植物根际土壤或定植于植物根表、根内的一类对植物生长有益的微生物[4]，可通过固氮、溶磷解钾、产生植物激素等途径促进植物生长[5]。徐立国等[6]研究发现，菌株3183贝莱斯茅芽孢杆菌（Bacillus velezensis）具有高产IAA能力，用其浇灌后的烟草地上部和地下部鲜重均高于对照。邢芳芳等[7]研究表明，菌株HB-1枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有较好的IAA生产能力，且对白菜生长具有明显促进作用。汪钱龙等[8]研究结果显示，菌株C-3解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）生长素分泌能力最强，可明显提高玉米鲜重、干重、株高等农艺性状指标。有报道称，促生菌Variovorax boronicumulansCGMCC 4969具有被寄主植物用来调节IAA水平的潜力[9]。此外，优化微生物发酵培养条件，可使菌株获得最大量的目标代谢产物。王呈玉等[10]优化XSF巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）促生菌剂发酵工艺条件，使其活菌数达到2.56×1010cfu/g。王勇等[11]优化促生菌株Bacillus amyloliquefaciensGZ-5发酵条件后，其菌体生物量及芽孢生成量均达到最佳。因此，对具有分泌IAA能力的植物根际促生菌的研究逐步成为微生物肥料研究的热点，而筛选具有产生IAA的微生物可为促生生物肥料的研发等提供菌株。

延边大学农学院植物生理生化实验室前期已对延边不同烟区、不同烟草品种内生及根际细菌群落进行了全面的分析，获得了多种原位细菌资源[12]。本试验拟进一步分离筛选具有产IAA能力的促生菌株，明确其分类地位，并采用液体摇瓶发酵单因素试验优化菌株培养条件，研究单细菌及混合菌剂对烟草种子萌发及幼苗生长发育的影响，以期为烟草促生生物菌剂的开发及应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 延边地区烟草根际土壤。

1.1.2 培养基与试剂 LB肉汤培养基：蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，用于菌株液体培养；LA培养基：酵母膏5g、蛋白胨10g、NaCl 10g、琼脂粉15g，用于菌株固体培养；Salkowski试剂：35%高氯酸500mL、0.5mol/L FeCl310mL（现用现配）；其他试剂：1% CuSO4、0.5% ZnSO4、L-色氨酸、标准吲哚乙酸（IAA），以上生化试剂均为分析纯。细菌DNA提取及扩增试剂均为分析纯，Taq酶、dNTP、Buffer Mg(-)、MgCl2等购自宝生物工程（大连）有限公司。细菌通用引物27f和1492r由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 烟草种子 供试烟草品种为吉烟9号，由延边州农业科学研究院烟草研究所提供种子。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离 于2017年6月在吉林省延边烟草种植区采集样本，采用五点取样法选取健康烟株，轻轻抖落附着的土壤，截取烟株根部放置于自封袋中，装入冰盒迅速带回实验室。小心取出烟根，将其置于500mL容量瓶中，加入200mL磷酸盐缓冲液（pH=7.8），恒温摇床200转/min振荡20min后，将洗脱的土壤混悬液离心，弃上清液，所得沉淀即为根际土样品。将1g烟草根际土壤放入无菌三角瓶中，加入9mL生理盐水震荡20min，静置5min，待土壤均匀分散开，按10倍递减稀释法稀释后于LA培养基上涂布。细菌分离纯化后，挑取单菌株置于30%甘油中，于-80℃冰箱中保存备用。

1.2.2 产IAA菌株的筛选 定性初筛：向灭菌后的LB液体培养基加入100mg/L L-色氨酸，接入供试菌株180转/min培养2d，4 000转/min离心10min，吸取2mL上清液，加入等体积Salkowski比色液，避光静置30min，观察其颜色变化，以50mg/L的标准IAA作对照，变粉红色为具有产IAA能力的菌株。

定量复筛：将菌株接种于LB液体培养基中震荡培养24h后，在600nm波长分光光度计下调节OD600值为0.8后备用。将菌株发酵液4 000转/min离心10min，吸取3mL上清液，加入等体积Salkowski比色液，重复3次，静置30min后测定530nm处的吸光值，以未接菌的LB液体培养基为空白对照，以IAA浓度为横坐标、OD530为纵坐标制作IAA标准曲线，通过标准曲线计算IAA产量[13-14]。

1.2.3 产IAA菌株的鉴定 采用改进的SDS-CTAB方法提取细菌基因组DNA[15]，选用16S rRNA通用引物27f/1492r，以细菌DNA为模板，配制25 μ L PCR反应体系进行扩增[12]。PCR产物委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序，扩增产物测序结果在GenBank进行BLAST比对以获取相似性最高的植株。

1.2.4 菌株间拮抗反应测定 将筛选出的产IAA能力最大的2株菌株m-53和m-60进行拮抗反应测试。菌株活化后两两相交接种于LB平板上，并在30℃下培养24～48h，观察接触部位细菌生长情况，若接触部位细菌生长不良或不生长，则说明这2株菌株之间存在拮抗作用，不宜混合培养；反之，则说明2株菌株之间无抑制作用，可以混合培养。

1.2.5 产IAA菌株培养时间的确定 采用单因素法，于摇床分别振荡培养12、24、36、48、60、72和84h，计算出相应的IAA产量，从而确定最佳培养时间。

1.2.6 烟草种子萌发试验 根据最佳培养时间培养产IAA菌制备菌悬液，种子经1% CuSO4和0.5%ZnSO4溶液分别浸种30和15min，无菌水冲洗3～5次备用。将消毒后的烟草种子在菌悬液中浸泡30min，对照（CK）为未接菌处理，种子浸泡在无菌液体培养基中。将种子置于灭菌后的培养皿中，每皿100粒，重复3次，于26℃光照培养144h，每12h观察种子萌发情况，于第7天测定苗长和根长。计算发芽指标：发芽势、发芽率、发芽指数（发芽指数=∑Gt/Dt，Gt为发芽试验终期内每日发芽数，Dt为发芽日数）、活力指数（活力指数=GI×S，GI为发芽指数，S为规定日期内幼苗或幼根的长度或质量）。

1.2.7 烟草盆栽育苗试验 将经表面消毒后的烟草种子与菌悬液拌种处理，均匀播撒在混有细砂的灭菌花盆中，以无菌液体培养基拌种作为对照，出苗后每隔1周灌根1次。出苗后第30天，取10株长势均匀一致的烟苗测定其株高、茎围、叶片数、根长、最大叶长、最大叶宽、地上部鲜重和地下部鲜重。

1.3 数据处理

利用Excel 2010绘制图表，利用SPSS 17.0对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 产IAA菌株的筛选与鉴定

经定性筛选得到产IAA菌株27株。通过定量测定（表1），发现菌株m-53与m-60产IAA量超过40.00mg/L，故挑选这2株菌株进行下一步研究，其形态示于图1；经分子鉴定获得m-53与m-60 16S rRNA的相似性比对结果（表2）。

表1 烟草根际细菌产IAA能力Table 1 The ability of IAA production of rhizosphere bacteria from tobacco mg/L

图1 m-53和m-60菌株形态Fig.1 Morphology of m-53 and m-60 strains

表2 细菌16S rRNA序列与GenBank-BLAST比对结果Table 2 Comparison of 16S rRNA sequence and GenBank-BLAST of bacteria

2.2 菌株间的拮抗测定

菌株间拮抗测定结果（图2）显示，m-53与m-60菌株间不发生拮抗反应，即2种菌株可以混合培养。

2.3 培养时间对菌株生长及产IAA含量的影响

由图3可知，菌株m-53生长迅速且于培养24h时OD600达到最大值；菌株m-60初始生长缓慢，但于培养48h时OD600达到最大值；2株混合培养OD600最大值高于单独培养，且于培养60h时达到峰值，说明二者具有相互促进的作用。

图2 m-53与m-60菌株间拮抗反应结果Fig.2 The results of antagonistic reaction between m-53 and m-60 strains

图3 培养时间对菌株及其组合生长的影响Fig.3 The effects of culture time on the growth of strain and its combination

由图4可以看出，在培养24h时，菌株m-53产IAA最多，且显著高于其他培养时间；菌株m-60在培养48h时产IAA最多；2株混合培养在48h时IAA产量最高。

图4 培养时间对菌株及组合产IAA能力的影响Fig.4 The effects of culture time on IAA production ability of strain and its combination

2.4 产IAA菌株对烟草种子萌发的影响

由表3可知，2种促生菌单独施用和混合施用都可以增加吉烟9号烟草种子的发芽指标。对于发芽势来说，混合施用显著高于其他处理，与CK相比增加了30.61%；对于发芽率来说，施菌处理高于CK，但无显著差异；对于发芽指数来说，混合施用效果最佳，且比CK增加19.64%；对于活力指数来说，施用m-53与混合施用均显著高于CK，其中混合施用效果最佳，与CK相比增加25.39%。综上，2种促生菌均能促进烟草种子萌发且混合施用比单独施用效果更好。

表3 促生菌对烟草种子发芽指标的影响Table 3 The effects of bacteria on germination indexes of tobacco seeds

2.5 产IAA菌株对烟草幼苗农艺性状的影响

由表4和图5可知，m-53单独施用和2种促生菌混合施用对烟草的株高、根长、最大叶长、最大叶宽、茎围和叶片数均有促进作用，且混合施用的效果最佳，除根长外，m-60与CK无显著差异。

表4 促生菌对烟苗农艺性状的影响Table 4 The effects of bacteria on agronomic traits of tobacco seedlings

图5 促生菌对烟苗生长的影响Fig.5 The effects of growth-promoting bacteria on the growth of tobacco seedlings

2.6 产IAA菌株对烟苗生物量的影响

由表5可知，m-53单独施用和2种促生菌混合施用对烟苗生物量均有显著影响，且混合施用的效果更佳。m-60与CK间根冠干重比差异显著。与CK相比，混合施用对烟苗地上部干重和鲜重、地下部干重和鲜重，及干重和鲜重根冠比有显著增加的作用，地上部鲜重为CK的2.3倍，地上部干重为CK的2.63倍，地下部鲜重为CK的4.31倍，地下部干重为CK的4.57倍。根冠比反映植物地下部与地上部的相关性，鲜重根冠比相较于CK增加了86.11%，干重根冠比相比于CK增加了68.81%。

表5 促生菌对烟苗生物量的影响Table 5 The effects of bacteria on biomass of tobacco seedlings

3 讨论

IAA作为植物中最重要的生长素之一，其作用主要有促进植物生长和细胞分裂、增加并促进根的分化及其生物量的增大、维持顶端优势等。低浓度的IAA促进细胞的伸长；当浓度高到一定值时，会抑制其促进细胞伸长的作用。目前，国内外有关PGPR产IAA的研究多集中在芽孢杆菌属（Bacillus）、肠杆菌属（Enterobacter）、固氮菌属（Azotobacter）等[16-17]，但不同菌株IAA分泌量差异较大。本试验分离筛选产IAA菌株鞘氨醇杆菌属（Sphingobacteriumsp.）m-53与咸海鲜球菌属（Jeotgalicoccussp.）m-60，其产IAA能力分别为43.06和41.37mg/L，略高于吴翔等[18]从烟草根际土壤中分离筛选的Bacillus flextts菌株（28.16mg/L）；与张英等[19]从西藏阿里地区采集披碱草根系及根际土壤中筛选出的菌株NXP17分泌IAA能力相差不大。

优化菌株培养条件可实现菌株生产最大化。本试验通过单因素试验确定m-53、m-60及二者混合的最佳培养时间分别为24、48和48h，其对应的IAA产量分别为98、41和141mg/L。研究表明，菌株的生产发酵效率与培养基组分及培养条件有密切关系[20]。徐婧等[21]对产IAA菌株GMZB-12进行优化后，IAA产量为36.88mg/L，比优化前提高7.75mg/L。

生长素是促进不定根形成的主要因素，可以调控侧根的形成，外源施加生长素可以激活中柱鞘形成侧根原基[22]。研究表明，PGPR促生效果明显，能有效提高农作物对土壤中养分的吸收和转化且提高作物的生物量。王婧[23]用浓度为106cfu/mL的橘黄假单胞菌JD37菌液浸种和107cfu/mL的菌液处理幼苗，发现其对番茄种子及幼苗均具有一定的促生作用。Zemrany等[24]在试验中通过增施促生菌肥提高玉米鲜重34%。王辰月等[25]研究中也发现产IAA细菌对种子萌发具有促进作用。本试验通过研究产IAA促生菌单菌株和混合菌株对烟草种子萌发及幼苗生长发育的影响，结果表明单独施用和混合施用菌株均能促进种子萌发，能有效提高烟苗各项农艺性状及生物量，且混合施用菌株优于单独施用，这与刘青海[26]试验结果一致。产IAA促生菌一般同时具有多种促生功能，但菌株m-53与m-60的促生作用机理尚有待于进一步研究。

4 结论

本试验从延边烟草根际土壤中筛选出的鞘氨醇杆菌属（Sphingobacteriumsp.）m-53与咸海鲜球菌属（Jeotgalicoccussp.）m-60产IAA效果较好，优化培养条件后发现m-53、m-60及二者混合的最佳培养时间分别为24、48和48h，其对应的IAA产量分别为98、41和141mg/L。与对照相比，在种子萌发及盆栽试验中发现，单一菌和混合菌剂均能促进种子萌发及幼苗生长，尤以混合菌剂效果最佳。