春油菜区抗跳甲油菜资源的筛选

2020-04-28柳海东余青兰王瑞生杜德志

作物杂志 2020年2期

柳海东余青兰王瑞生杜德志

（青海大学农林科学院/青海省春油菜遗传改良重点实验室/国家油菜改良中心青海分中心/农业农村部春油菜科学观测实验站/青海省春油菜工程技术研究中心，810016，青海西宁）

油菜是世界四大油料作物之一，是我国最主要的油料作物，年种植面积730万hm2[1]。根据我国油菜对温度需求的不同可以分为冬性、半冬性和春性油菜三大生态类型，春油菜主要分布在甘肃、内蒙古、新疆、青海等高海拔、高纬度、无霜期较短的冷凉地区，年种植面积在66万hm2左右。我国春油菜区3种类型[甘蓝型B. napusL.，AACC，2n=38；芥菜型油菜B. junceaL.，2n=36；白菜型B.rapa(campestris) L.，2n=20]的油菜都有种植，其中，以甘蓝型油菜为主[2-3]。

在作物生产中，有各种生物压力阻抑着其生长潜力的发挥，在这些生物压力中，害虫严重威胁作物生长[4]。油菜整个生育期都有害虫为害，苗期主要受跳甲（油菜蚤跳甲Psylliodes punctifronsBaly）、油菜黄曲条跳甲[Phyllotreta striolata(F.)]等为害[5]。近年来，随着油菜种植面积不断扩大，以及多年来单一使用化学农药防治油菜跳甲，使油菜跳甲对多种杀虫剂的抗性普遍提高，其发生与为害越来越严重。在南方，跳甲已取代小菜蛾（Plutella xylostellaL.）而上升为蔬菜生产上的头号害虫[6]；在春油菜区，跳甲是油菜苗期常发性害虫，主要以油菜蚤跳甲和油菜黄曲条跳甲为主，常造成春油菜大面积减产或毁种重播[7]。鉴于跳甲给油菜、蔬菜生产造成的极大危害，许多学者从生物学、种群动态及影响因子、空间分布型、植物提取物、天敌和生态控制等方面对其进行了大量的研究工作。张茂新等[8]调查发现，黄曲条跳甲在十字花科一季菜生长期内与寄主植物生长发育期密切相关；在油菜黄曲条跳甲防治方面，目前比较有效的方法是采用生物防治和物理防治，如引入跳甲天敌、轮作、覆地膜、灯光诱杀，根据黄曲条跳甲趋黄性还可采取黄板诱杀等方法[9-10]。此外，3种植物提取物香茅草精油、香茅草提取液和白千层精油对油菜黄曲条跳甲成虫具有一定的防效[11]。在黄曲条跳甲种群控制方面，斯氏线虫可有效控制其幼虫种群数量，通过植物次生代谢产物的开发利用也可有效控制黄曲条跳甲种群数量[12-13]。

在作物抗虫育种中，研究昆虫的寄主选择是评价和研究作物抗虫性的一个重要方法，通过对昆虫寄主选择的研究，筛选有效的抗性品种作为抗虫种质资源，可运用于作物抗虫育种之中；抗虫因子是指导作物抗虫育种的重要依据，在抗虫因子中，植物营养物质的含量和防御酶起着非常重要的保护作用[14-15]，植物在昆虫的取食迫害下，激发了体内的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）等防御蛋白的产生，它们能够使昆虫中毒或者营养失调，这些防御蛋白含有能够对外源生物体造成伤害的自由基，通过防御蛋白间的相互反馈调节使自身自由基保持在正常水平，以此提高自身抗虫性，减少害虫的进一步为害[16]。对抗病和易感小麦品种进行蚜虫侵染诱导，发现PAL、PPO、POD 3种防御性酶活性在不同小麦品种不同发育阶段都出现不同程度的升高，说明这3种酶在小麦抗蚜虫上具有一定的潜力[17]；PPO与植物抗虫性有着密切的关系，其主要作用机制是：催化酚类物质氧化为醌，并将一些必需氨基酸烷基化，醌类物质能抑制害虫的消化系统，使其营养失衡。茉莉酸甲酯模拟虫害取食甘蔗试验证明，甘蔗在经过诱导处理后，产生了大量的PPO[18]。POD是参与植物应对逆境反应过程的关键酶之一，POD通过与部分酚类物质结合，产生苯氧基和氧自由基，进而直接影响植食性昆虫的取食，或者产生毒素，降低叶片的营养水平及其可食性[18]。SOD主要功能是将植物中过量的氧原子转化为水，有效控制活性氧的损害，避免或减轻虫害带来的损伤，从而提高寄主植物的抗虫性[19]。PAL在苯丙烷类代谢途径中起着限速的关键作用，其代谢过程可产生酚类物质、木质素、植保素和阿魏酸等有毒次生物质，这些物质对植物的生长发育和防御病虫害的攻击有着重要作用[20]，在大麦中，PAL活性对抗蚜虫起关键作用[21]。

本试验通过分析油菜苗期田间跳甲为害指数及4种防御性酶活性，研究不同油菜品种（系）对跳甲的抗性，从中筛选抗跳甲油菜资源，初步探讨油菜抗跳甲机制，为油菜抗跳甲育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试的生态型油菜品种（系）共42个，其中春性品种（系）38个，半冬性品种4个。供试品种（系）全部由青海大学农林科学院春油菜研究所提供，详见表1。

表1 不同油菜品种（系）及来源Table 1 Ecotypes and sources of different rapeseed varieties (lines)

1.2 田间调查跳甲为害指数

采用单因素随机区组设计，3次重复。每小区5行，行长2.5m，行距0.3m，每小区调查株数不少于70株。试验材料于2017年3月28日、2018年3月30日播种于青海省农林科学院试验地，油菜2叶期调查跳甲为害情况。苗期不施任何农药，土肥水管理按常规进行。

参照贺春贵等[22]油菜蚤跳甲的为害分级方法，在油菜2叶期，调查每小区中间3行跳甲为害情况。为害情况分4级，分别为0级（未受任何损害）、1级（有损害但未形成穿孔）、2级（有洞或叶片缺失介于1/2～1）和3级（1片以上叶片缺失或心叶缺失）。计算为害指数，为害指数=（各级值×相应级的株数的累计值）/（调查总株数×最高级数）×100%。利用DPS（7.05）软件进行方差分析、卡方聚类及相关性分析。

1.3 防御性酶活性检测

PAL、PPO、POD和SOD活性测试盒均由南京建成科技有限公司生产。4种酶吸光值测定及计算方法按试剂盒说明书进行。在2018年油菜出苗生长至2叶期，在田间调查为害率的同时取样。

1.3.1 PAL活性测定取幼嫩子叶5g，将叶片研磨后按子叶重量（g）∶提取液体积（mL）=1∶9加入45mL提取液，冰水浴匀浆，10 000转/min，4℃离心10min，取上清液待测。

1.3.2 PPO活性测定取幼嫩子叶5g，将叶片研磨后按子叶重量∶提取液体积（mL）=1∶5加入25mL提取液，冰水浴匀浆，8 000转/min，常温离心10min，取上清液待测。

1.3.3 POD活性测定取幼嫩子叶5g，按子叶重量（g）∶匀浆介质体积（mL）=1∶9加入45mL匀浆介质（磷酸盐缓冲液：0.1mol/L，pH 7.0～7.4），冰水浴条件下制备成10%的组织匀浆，3 500转/min，4℃离心10min，取上清液待测。

1.3.4 SOD活性测定取幼嫩子叶5g，按子叶重量（g）∶生理盐水体积（mL）=1∶9加入45mL生理盐水，再剪碎组织，冰水浴制备匀浆，2 500～3 000转/min，4℃离心10min，取上清液待测。

2 结果与分析

2.1 不同油菜品种（系）跳甲为害指数分析

不同油菜品种（系）跳甲为害指数的分析结果（表2）显示：2017年跳甲为害指数最低的是青杂2号、青杂12号、严小村芥、白芥和大辣芥，为害指数分别为32.51%、31.65%、35.64%、31.15%和31.00%，与目前春油菜区主栽品种青杂5号（45.49%）差异极显著；抗性相对较差的是大黄和青杂7号，为害指数分别为52.42%和59.29%。2018年对42个油菜品种（系）跳甲为害进行了鉴定，抗性相对较好的有大辣芥、青杂12号、白芥、ZG2017Y和青杂2号，为害指数分别为25.05%、33.65%、34.00%、35.45%和35.76%，与其余品种（系）为害指数差异极显著。抗性较差的是144A和39，为害指数分别为61.06%和54.02%，与其余品种（系）差异极显著。上述分析结果表明，青杂2号、青杂12号、白芥和大辣芥在田间苗期具有较强的抗跳甲能力。

表2 不同油菜品种（系）间跳甲为害指数分析Table 2 Analysis of the hazard index of jumping armor among different rapeseed varieties (lines) %

2.2 不同油菜品种（系）跳甲为害指数卡方聚类

图1 2018年不同油菜品种（系）为害指数卡方距离聚类Fig.1 Chi-square distance clustering for the hazard index of different rapeseed varieties (lines) in 2018

为了进一步分析不同油菜品种（系）抗跳甲差异性，对2018年42个油菜品种（系）的跳甲为害指数进行卡方聚类分析，结果（图1）显示：在卡方距离为0.41时，42个品种（系）被分为4类；第Ⅰ类包括跳甲为害指数最高的大黄、青杂7号和青油14号等7个品种（系）；第Ⅱ类包括对照青杂5号，白菜型油菜浩油11号、中双7号、中双9号、中双11号，芥菜型油菜严小村芥等28个品种（系）；第Ⅲ类包括144A；第Ⅳ类包括青杂2号、青杂12号、2017ZZY、403R、白芥和大辣芥6个品种（系），这些品种（系）抗跳甲能力强。上述结果表明，通过跳甲为害指数卡方距离聚类，可以有效地将不同油菜品种（系）抗跳甲能力区分开来，其中青杂2号、青杂12号、2017ZZY、403R、白芥、大辣芥6个品种（系）抗跳甲能力最强。

2.3 2018年4种主要防御酶活性

42个油菜品种（系）苗期的PAL活性见图2，甘蓝型油菜青杂2号、青杂12号和芥菜型油菜白芥、大辣芥PAL活性介于20.00～23.00U/g，在所有品种（系）中最高，其中PAL活性最高的为青杂12号（22.75U/g）。甘蓝型油菜杜4695和白菜型青油21号PAL活性高于春油菜区主栽品种青杂5号（图 2a）。

PPO活性测定结果（图2b）显示，青杂12号、严小村芥、白芥和大辣芥PPO活性达到120.00～128.00U/g，显著高于其他品种（系），其中白芥和大辣芥PPO活性分别达到125.41和127.61U/g。此外，还有10个品种（系）PPO活性介于70.00～110.00U/g，高于春油菜区主栽品种青杂5号，在这些品种（系）中，只有2017ZZY为白菜型油菜，其余9个全为甘蓝型油菜（图2b）。

由POD活性测定结果（图2c）可知，42个品种（系）中有27个高于青杂5号，其中青杂2号、青杂12号、白芥和大辣芥POD活性达120.00～130.00U/g，显著高于春油菜区主栽品种青杂5号POD活性（95.00U/g），青杂12号最高（128.86U/g），比青杂5号高35.6%。

SOD活性测定结果（图2d）显示，青杂12号、白芥和大辣芥活性较高，分别为2 163.99、2 024.24和2 098.23U/g，显著高于其他品种（系）；此外，还有25个品种（系）SOD活性介于1 800.00～2 000.00 U/g，与春油菜区主栽品种青杂5号达到显著水平。

从以上结果可以看出，甘蓝型油菜青杂12号、芥菜型油菜白芥和大辣芥苗期4种防御性酶活性在所有供试材料中最高，在抗跳甲育种中，可以重点考虑用这3个材料作为选育亲本。

2.4 4种主要防御酶活性与跳甲为害指数相关性分析

图2 2018年不同油菜品种（系）苗期4种防御性酶活性检测结果Fig.2 The results of four defense enzyme activities in different rapeseed varieties (lines) at seedling stage in 2018

从42份不同甘蓝型油菜品种（系）2018年跳甲为害指数与4种主要防御酶活性相关性分析（表3）可知，2018年跳甲为害指数与4种主要防御酶活性呈极显著负相关，4种主要防御酶活性之间呈极显著正相关。以上相关性结果表明，油菜苗期防御性酶活性与跳甲为害程度是相互抑制的，而主要防御酶活性之间是互相促进的作用。

3 讨论

目前，跳甲对油菜苗期的为害程度衡量指标最常用的是田间为害指数。本研究通过对42个油菜品种（系）田间跳甲为害指数和4种主要防御酶活性检测，从跳甲为害指数田间调查结果可以看出，青杂2号、青杂12号、严小村芥、白芥和大辣芥在2年中跳甲为害指数都在30.00%左右，与其他品种（系）相比都较低；甘蓝型油菜跳甲为害指数显著高于白菜型油菜和芥菜型油菜，而芥菜型油菜为害指数最低，主要原因可能有以下几个方面：一是本研究选用的甘蓝型油菜均为双低品种（系），而白菜型和芥菜型均为双高品种（系），甘蓝型品种芥酸、硫甙含量较低，口感好，跳甲喜食；二是甘蓝型油菜品种（系）与其他两种类型相比，防御性酶活性较高的品种（系）为害指数较低；此外，油菜叶片刺毛对跳甲可能具有一定的防御作用，本研究所选用的几个白菜型油菜和芥菜型油菜品种（系）叶表面刺毛多于甘蓝型油菜品种（系）。

表3 2018年供试材料4种防御酶活性与为害指数相关系数Table 3 Correlation coefficient between hazard index and the activities of four defense enzymes in 2018

植食性昆虫首先是通过视觉和嗅觉寻找合适的植物，并成功定位植物，再开始取食植物组织获得营养物质满足自身发育[23]。昆虫对植物的侵害是一种依附生存，昆虫需要从植物体内汲取营养物质，比如一些糖类和蛋白质，来维持自身的生长发育，而植物为防御受到侵害通过调节自身营养物质含量来改变昆虫对寄主植物的选择，植物体内营养物质的含量往往与抗虫性有很大关系，尤其是一些可溶性糖和可溶性蛋白含量与抗虫性有很大关系[14，24]。化学杀虫剂的使用在保护作物生长的同时也带来一系列副作用，因此，从植物与昆虫的关系着手，研究植物的抗虫机制，对防治害虫有一定的帮助。同时，鉴定和筛选一些抗虫基因型，利用植物固有能力来抵御害虫侵害，减少实际生产中化学农药的使用。

防御酶PAL、PPO、POD和SOD是寄主植物防御害虫的主要生化指标，在植物抗病和抗虫中起着重要的作用。PAL是目前研究最多的防御性酶之一，主要原因是当植物受到外界刺激时，其在特定组织中的PAL含量会在短时间内发生显著波动。在高等植物中，PAL是苯丙基代谢的第一酶，对调节植物酚类物质的积累发挥着重要的作用，而酚类物质在植物抗病中的作用已经被证实[25]。POD和SOD是植物体内活性氧清除系统的主要酶，逆境条件下植物体内自由基会增多，导致植物体膜的结构和透性发生改变，POD和SOD能通过彼此调节作用维持植物体内自由基的平衡，从而减轻逆境对植物的伤害[19]。PPO是植物形成抗菌物质的主要酶，可以促进植物形成木质素，有利于修复损伤的细胞壁形成防御壁[26]。

也有研究表明，油菜中防御性酶PPO和SOD的活性与油菜对黄宽条跳甲抗性关系不明显[14]，但通过对水稻抗虫性研究表明，植物在受到害虫迫害时，这4种防御酶活性升高[26-27]。本研究结果也显示不同抗性油菜品种（系）间PAL、PPO、POD和SOD活性差异明显，并且不同油菜品种（系）跳甲为害指数与4种防御酶活性呈极显著负相关，说明抗跳甲能力越强的品种（系）这4种酶活性越强。从本研究结果可以看出，甘蓝型油菜青杂12号、芥菜型油菜大辣芥和白芥2年大田鉴定中跳甲为害指数最低，苗期4种防御性酶活性最高，是抗跳甲育种的理想材料。前期研究结果表明，芥菜型油菜跳甲抗性显著高于甘蓝型和白菜型[28]，本研究中共有6个芥菜型参试材料，其中有4个材料的跳甲为害指数显著低于大多数甘蓝型和白菜型品种（系），4种防御酶活性也高于其他供试品种（系），进一步说明芥菜型油菜具有较强的抗跳甲能力。此外，目前研究中4种防御酶活性之间也呈极显著正相关，这4种酶之间如何相互影响和互作机制目前尚不清楚，还需进一步研究。