不同贮藏温度条件下3个烟草品种花粉活力、形态及生理指标变化

潘 磊 许 杰 杨 帅 陈云松 陈连红 马文广

（玉溪中烟种子有限责任公司，653100，云南玉溪）

花粉是种子植物的雄配子体，具有丰富的遗传多样性，是种质保存和交换以及杂交育种的重要材料，其萌发后传递的父本遗传信息是种子形成的关键，在植物有性繁殖过程中起着重要作用[1]。在烟草杂交种种子的生产过程中，烟株必须经过花粉采集、人工授粉才能受精结实。高质量的花粉是烟草育种成功与否的关键，也是种子产量提升的前提，花粉的质量主要以活力来体现[2]。花粉活力是指花粉在适宜条件下萌发的能力。在室温及自然湿度条件下，烟草花粉的寿命只有15d左右[3]，如何贮藏花粉并保持其活力，是烟草杂交制种工作开展的关键环节之一。

1922年，Knowlton[4]发现-196℃贮存后的金鱼草（Antirrhinum majus）花粉仍具有一定的活力。花粉低温贮藏在20世纪80年代逐渐兴起，日本、美国、英国、印度和中国相继建立了花粉超低温保存中心（库）[5]。花粉低温贮藏的植物种类从最初的果树、农作物，逐渐发展到园林植物、蔬菜、牧草、药用植物等[6]。低温贮藏能显著延长花粉的寿命。前人研究发现，水稻[7]、紫菜苔[8]、辣椒[9]、芍药[10]、番茄[11]等花粉经长期超低温保存后依然具有较强的生活力，部分植物花粉保存10年以上仍能保持一定的活力[12-13]。目前，花粉贮藏的研究对象以果蔬及观赏性花卉为主，主要集中在花粉采集、贮藏前预处理、化冻方法以及花粉含水量对贮藏效果的影响方面，然而关于烟草花粉的贮藏以及不同贮藏方式对烟草花粉生理生化特性的影响研究较少。本试验研究了经过-196℃冷冻、-80℃冷冻和4℃冷藏3种方式保存后烟草花粉的活力变化、形态和内含物差异，为烟草花粉的适宜贮藏温度选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用3个不同的烟草类型N. rustica、Maryland 609和云烟85为试验材料。其中，N. rustica为野生烟，Maryland 609为白肋烟，云烟85是目前生产上主要种植的烤烟品种之一。

1.2 试验设计

试验于2017年2月在玉溪中烟种子有限责任公司西双版纳冬繁基地开展。取N. rustica、Maryland 609和云烟85成熟花朵，剥出花药于室内晾制，待其完全散粉后，以0.2g为一个单位分装入2mL冻存管内进行贮藏，设置3个处理：-196℃（液氮）、-80℃（超低温冰箱）和4℃。期间每月定期取样检测花粉活力，比较不同处理间花粉活力变化的差异。贮藏16个月后，于2018年6月取样检测花粉形态及生理指标变化。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 花粉活力检测 从2017年2月开始，每月定期取样，通过液体培养基离体萌发法检测花粉活力。培养基配方：10%蔗糖，50mg/L硼酸和50mg/L CaCl2；取500 μ L液体培养基加入2mL离心管中，加入待测花粉，花粉浓度2.5mg/mL左右，混合均匀后将离心管置于25℃光照培养箱中，黑暗培养1.5h，取 40～50 μ L 滴入凹形载玻片凹槽，于 10×物镜下进行镜检，以花粉管长度超过花粉粒直径作为萌发标准，每个处理设3次重复（制3个片），每个重复随机观察3个视野，统计花粉萌发率。

1.3.2 花粉电镜照片拍摄 新鲜花药在空气中自然干燥散粉后，撒于样品台的两面胶上，真空喷金后，在Hitachi S-520型扫描电子显微镜下观察并拍摄照片。

1.3.3 花粉游离氨基酸总量测定 采用总氨基酸（T-AA）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定游离氨基酸总量。

1.3.4 花粉内含物测定 采用硫酸-苯酚法测定可溶性糖含量；采用酸性茚三酮法测定脯氨酸含量；采用考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白含量；采用氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量[14]。

1.4 数据处理分析

采用DPS 7.05进行统计分析，用LSD法进行多重比较；采用Excel进行图表的制作。

2 结果与分析

2.1 不同贮藏条件下烟草花粉活力变化

3个不同类型的烟草参试品种在不同贮藏温度条件下花粉活力的定期检测方差分析结果如表1所示。从表1数据可以看出，经-196℃冻存16个月后的花粉，3个参试品种N. rustica、Maryland 609和云烟85的活力分别为0.64±0.06、0.65±0.08和0.64±0.07，与贮藏前活力检测数据0.66±0.04、0.66±0.07和0.64±0.09比较，均无显著差异；-80℃贮藏条件下，3个参试品种花粉在贮藏前活力分别为0.65±0.06、0.64±0.12和0.63±0.08，贮藏16个月后活力分别为0.65±0.09、0.64±0.11和0.64±0.05，可见，-80℃温度条件下，花粉活力在贮藏16个月后无显著变化；而在4℃贮藏条件下，库存花粉活力表现出逐月下降的趋势。以参试品种N. rustica为例，贮藏前花粉活力为0.65±0.10，经4个月贮藏后花粉活力下降至0.08±0.02，之后的月份未能检测到花粉活力。这表明烟草花粉在-196℃和-80℃条件下长时间（16月）保存，花粉活力能得到有效保持。

表1 不同贮藏温度条件下参试烟草品种花粉活力定期检测结果Table 1 Results of pollen vitality of the tested tobacco varieties under different storage temperature conditions

2.2 不同贮藏温度条件下烟草花粉群体形态差异

不同贮藏温度条件下，3个烟草类型的花粉形态列于图1中。从图1可以看出，经-196℃和-80℃温度条件冻存16个月后，烟草花粉的形状规则，呈长椭圆形，内含物饱满，外壁清晰，萌发沟均匀分布。而经4℃冷藏16个月后的花粉则发生了明显皱缩，萌发沟扭曲，花粉形状不规则。这表明，-196℃和-80℃温度条件下保存有利于烟草花粉形态的保持。

图1 不同贮藏条件下烟草花粉群体电镜照片Fig.1 Electron micrograph of tobacco pollen population under the different storage conditions

2.3 不同贮藏温度条件下烟草花粉可溶性糖含量差异

可溶性糖作为渗透调节物质，可以增加细胞渗透压，提高保水能力，还可以降低细胞质冰点，防止细胞质凝胶凝固。分析不同贮藏温度条件下参试烟草花粉可溶性糖含量差异（表2），以参试品种中野生种N. rustica为例，贮藏16个月后，-196℃和-80℃贮藏条件下的花粉可溶性糖含量分别为309.276±2.989和286.808±8.476mg/g，差异不显著；与4℃冰箱中花粉可溶性糖含量158.056±8.484mg/g相比较，差异显著，可溶性糖含量分别提升95.67%和81.46%。Maruland 609和云烟85的数据变化规律均与N. rustica一致。结果表明，烟草花粉在-196℃和-80℃条件下保存有利于其可溶性糖含量的保持。

表2 不同贮藏温度条件下烟草花粉可溶性糖含量Table 2 Soluble sugar content of tobacco pollen under the different storage temperatures mg/g

2.4 不同贮藏温度条件下烟草花粉游离氨基酸总量差异

游离氨基酸既能增加细胞液的浓度，又能提高原生质的保水能力及胶体的稳定性。以参试品种N. rustica的花粉游离氨基酸总量检测结果为例（表3），不同贮藏温度条件下，烟草花粉游离氨基酸总量按贮藏温度自低而高排列分别为15.817±2.136、24.152±1.395、12.574±0.132 μ mol/mg， 不 同 贮 藏温度间游离氨基酸含量差异达到显著水平。结果表明，花粉在-80℃条件下保存有利于花粉中游离氨基酸总量的保持。

表3 不同贮藏温度下烟草花粉游离氨基酸总量Table 3 Total amount of free amino acids in tobacco pollen under the different storage temperatures μ mol/mg

2.5 不同贮藏温度条件下烟草花粉脯氨酸含量差异

脯氨酸与植物的抗寒性密切相关。由表4可知，以参试品种N. rustica数据为例，-80℃贮藏条件下花粉的脯氨酸含量最高（1.626±0.061mg/g），其次是-196℃（1.596±0.076mg/g），但二者在统计学上的差异没有达到显著水平；4℃条件下花粉的脯氨酸含量最低（1.328±0.053mg/g），显著低于-196℃和-80℃贮藏条件下的花粉。这表明，花粉的液氮保存和-80℃保存有利于保持花粉中的脯氨酸含量。

表4 不同贮藏温度条件下烟草花粉脯氨酸含量Table 4 Proline content of tobacco pollen under the different storage temperatures mg/g

2.6 不同贮藏温度条件下烟草花粉可溶性蛋白含量差异

可溶性蛋白具有亲水胶体的性质，能增强细胞的持水力，因而在低温胁迫下，植物体内可溶性蛋白含量的升高有利于抗冷性的提高[15]。统计不同贮藏温度条件下参试烟草品种花粉可溶性蛋白含量差异（表5），以参试品种N. rustica为例进行分析，可以看出-196℃和-80℃贮藏条件下花粉的可溶性蛋白含量（分别为55.216±1.615和53.001±1.605mg/g）没有显著性差异，但均显著高于4℃贮藏条件下花粉的可溶性蛋白含量（42.410±2.072mg/g）。这表明，花粉经液氮保存和-80℃保存后，花粉中的可溶性蛋白含量显著升高。

表5 不同贮藏温度条件下烟草花粉可溶性蛋白含量Table 5 Soluble protein content of tobacco pollen under the different storage temperatures mg/g

2.7 不同贮藏温度条件下烟草花粉SOD活性差异

SOD是植物体内普遍存在的一种清除超氧阴离子自由基的酶，能够将超氧阴离子自由基催化转变为H2O2，维持体内活性氧代谢平衡，从而保护膜结构[16]。由表6可知，不同贮藏温度条件下3种类型烟草花粉SOD活性为-80℃＞-196℃＞4℃，彼此间差异均达到显著水平。在-80℃条件下贮藏的烟草花粉SOD活性高于-196℃条件下贮藏的花粉，可能是由于未经速冻的花粉在-80℃环境中降温时间长于液氮-196℃，逆境胁迫导致SOD活性有所上升。4℃贮藏条件下花粉SOD活性最低，可能是因为贮藏时间过长，导致SOD活性下降。

表6 不同贮藏温度条件下烟草花粉SOD活性Table 6 Tobacco pollen SOD activity under the different storage temperatures U/g

2.8 不同贮藏温度条件下烟草花粉MDA含量差异

MDA是膜脂过氧化的产物之一，其浓度在一定程度上代表了膜脂过氧化强度和膜系统伤害程度，是最常用的膜脂过氧化指标[16]。分析表7中列出的数据，以参试品种N. rustica为例，-196℃和-80℃中花粉的MDA含量分别为2.205±0.092和2.250±0.168 μ mol/g，两者无显著差异，而4℃条件下花粉的MDA含量为8.134±0.349 μ mol/g，与-196℃和-80℃贮藏条件下的花粉MDA含量呈显著差异。这一结果表明烟草花粉于-196℃和-80℃条件下贮藏能够减少MDA的积累。

表7 不同贮藏温度条件下烟草花粉MDA含量Table 7 MDA content of tobacco pollen at the different storage temperatures μ mol/g

3 讨论

低温贮藏可以有效降低花粉呼吸强度和酶活性，以延缓花粉的衰老进程，且温度越低，花粉保存效果越好[17-18]。随着贮藏时间的推移，花粉活力不断降低，研究花粉低温贮藏的相关技术及机理特性对花粉种质资源保存、杂交育种等具有重要意义。

在低温状态下，花粉细胞新陈代谢基本停止[19]，因此，低温保存成为保持花粉活力行之有效的措施之一[20-21]。赵婵璞等[22]研究发现，-80℃贮藏条件可使有斑百合花粉活力保持2年以上。Ganeshan等[5]发现保存5年的葡萄花粉活力基本不变，但与新鲜花粉相比，其授粉后结实能力存在差异。Rajasekharan等[23]对超低温保存枸桔花粉的研究结果表明，超低温对花粉活力影响不显著。有关花粉在液氮中保存的最长期限、花粉活力是否随保存时间的增加而发生变化等问题还有待继续追踪检测。在本研究中，4℃条件下贮藏的花粉经5个月后已经检测不到花粉活力，而经-196℃和-80℃冻存16个月的花粉，其活力在贮藏前后无显著变化。结果表明，-196℃和-80℃对烟草花粉的贮藏有利，然而上述条件下，烟草花粉的最长贮藏时间还有待继续监测。

目前，关于花粉形态的研究多集中在花粉形态特征与亲缘关系相关性以及植物形态学分类上[24-26]，而有关花粉冻存后形态变化的研究较少。在本研究中，经-196℃和-80℃冻存16个月后烟草花粉形状规则，呈长椭圆形，内含物饱满，外壁清晰，萌发沟均匀分布；而经4℃冷藏16个月后的花粉则发生了明显的皱缩，萌发沟扭曲，花粉形状不规则。这与花粉活力的测定结果相对应，表明-196℃和-80℃对烟草花粉形态和活力的保持有利，而4℃冷藏中花粉发生皱缩、变形和扭曲，很可能是花粉内含物（糖、蛋白和氨基酸）经代谢消耗的结果。

细胞学和酶学研究表明，植物种质在超低温条件下遗传性稳定，贮存期较长[27]。在低温逆境胁迫条件下，植物体内可溶性蛋白和可溶性糖含量提高并维持在一定水平有利于植物抗寒性的提高[15，28-29]。研究[28，30]表明，可溶性蛋白在植物组织受到环境胁迫时会增加，其亲水性极强，能够增强细胞的持水力，可以减轻因原生质结冰而造成的细胞伤害。同样，可溶性糖含量增加也可提高植物细胞的渗透调节能力，同时降低细胞原生质的凝固点，增强抗冻能力，维持细胞膜在低温条件下的正常功能。通常情况下，植物体内的游离氨基酸维持在一个较低的水平，而在低温胁迫下，游离氨基酸大量积累，增加细胞液浓度，提高原生质的保水能力和胶体的稳定性[6]。在游离氨基酸中，脯氨酸与植物抗寒性密切相关。脯氨酸的疏水吡咯环与蛋白质分子的疏水区结合，而亲水基团分布于表面，增强了蛋白质的可溶性。在0℃条件下贮存10d的番茄花粉脯氨酸含量明显提高，而在-196℃温度下贮存的花粉脯氨酸含量没有明显变化[11]。表明在-196℃条件下，细胞内所有代谢活动基本停止，从而保持花粉具有较高活力。0℃条件下保存的花粉，其脯氨酸含量明显增加，这可能是花粉对低温的一种适应性反应，也可能是受害的标志[31]。在本研究中，贮藏16个月后，-196℃和-80℃贮藏条件下的花粉可溶性糖和可溶性蛋白含量差异均不显著，但都显著高于4℃条件下的花粉。不同贮藏温度下烟草花粉游离氨基酸和脯氨酸含量均表现出-80℃＞-196℃＞4℃的规律，出现该现象的原因初步推测为低温冻存的花粉自然解冻时间较长，在此过程中生成并积累了游离氨基酸和脯氨酸。该推测在后续工作中将设计试验进行探究。

植物遭受低温伤害时，细胞膜产生龟裂，膜的通透性增大，膜结合酶结构发生改变，导致植物细胞生理代谢变化和功能紊乱[30]。SOD对生物体内自由基的清除具有极其重要的意义，通过测定SOD活性水平高低可检测生物体衰老与死亡状态特征[32-33]。MDA含量的高低可以在一定程度上代表膜受伤害的程度[16]。在本研究中，不同贮藏条件下烟草花粉SOD活性表现为-80℃＞-196℃＞4℃，而4℃贮藏条件下花粉中MDA含量显著高于-196℃和-80℃贮藏条件下的花粉。-80℃贮藏条件下花粉中SOD活性高于-196℃贮藏条件下的花粉，主要是由于花粉在-80℃环境下的降温过程更长，导致SOD活性有所上升。而4℃中SOD活性最低，主要是因为该贮藏温度条件下花粉细胞生理活动仍在继续，导致细胞衰老死亡，表现为SOD活性下降。总而言之，与4℃贮藏条件相比，烟草花粉在-196℃和-80℃条件下贮藏能够保持较强的氧自由基清除能力，有害物质的积累相对较少。

花粉经低温冻存后能否保持其育性，是低温冻存技术应用于生产实际的关键。刘燕等[34]对梅花花粉进行超低温保存（-196℃），授粉结果表明超低温保存后的花粉仍具有授粉结实能力，座果率高于新鲜花粉。在烟草方面类似的报道较少，不同温度贮藏对烟草花粉田间授粉质量的影响，是下一步需要继续研究的内容。

4 结论

烟草花粉在-196℃和-80℃保存16个月后，仍然保持着高活力，花粉形态无显著变化；在4℃保存的花粉在保存5个月之后丧失活力，花粉粒形态发生皱缩和畸形。烟草花粉在-196℃和-80℃条件下保存，其可溶性糖、可溶性蛋白、游离氨基酸、脯氨酸含量和SOD活性5项指标均高于4℃条件下花粉，烟草花粉通过提高细胞的保水能力、胶体的稳定性以及清除氧自由基的能力来应对低温胁迫。