闪式提取法在植物组织中提取总黄酮的研究进展*

张 杨，卢泳冀，王晨曦，张燕军，郭建敏

(1 西南医科大学卫生检验检疫，四川 泸州 646000；2 西南医科大学基础医学院，四川 泸州 646000)

作为中草药化学成分研究的基本步骤和中药现代化过程中的关键环节，提取这一过程的成功与否及其工业化推广的难度、对环境的影响越来越引起人们的重视。其主要评价标准除了提取物收率高低外，快速、节能、安全、方便和环保陆续成为评价一个提取方法优劣的重要标准。其中的安全包括两方面的内容，即操作安全和成分不被破坏。传统提取方法如浸渍法、碱提法、煎煮法、回流法、连续回流法、渗漉法等已为人们熟知[1]，超声波提取法[2]、微波提取法[3]及超临界萃取法[4]等渐被人们接受，其优缺点及应用潜力正在经受实践的检验。近年来，用于研究的组织破碎提取法的闪式提取器在经过十余年的初步实践后，已显示出其独特的优势，但远未达到被推广应用的水平。对此，本研究在此将对组织破碎提取法的创制与实践进行作简要介绍，并以从一些中草药材中提取总黄酮的实际情况为引，为读者作一次组织破碎提取法(亦同“闪式提取法”)与其它提取方法的比较。

柚皮素(Naringenin)结构如图1所示，为白色针状晶体，分子式C15H12O5，分子量272.25，熔点260 ℃，溶于乙醇、乙醚和苯，几乎不溶于水。柚皮素分子显中极性，由于分子内含有苯环、羟基、羰基等官能团，所以在紫外区有吸收，吸收波长为325 nm。

图1 柚皮素的化学结构式Fig.1 Chemical structural formula of naringenin

1 方法简介

闪式提取法简介，在中草药常用提取方法中，除了传统且常用的水蒸气蒸馏法、压榨法、升华法外，所有方法都与溶剂有关，故这些方法又统称为溶剂提取法。经验和事实证明，溶剂提取法是较为先进的方法，在操作难度和提取率上都优于上述其他方法。在溶剂提取法中，影响提取效率的主要因素有溶剂(介质)的性质、物料的性质、外力的影响和介质的温度。闪式提取法又叫组织破碎提取法，其最早的理论探索和运用是1989 年，由日本生药学家采用生物组织捣碎机分离出了中草药中的丹宁成分[5]。1993年，刘延泽等[6]结合实际工作首次提出“植物组织破碎提取法”的概念，并基于此对含不同类型化学成分的中草药进行了相关的提取研究，并取得了较好的效果。

1994年，韩建海等在植物组织破碎这种当时的创新方法的实践基础上，自主研制出首台能用于植物硬组织破碎提取的样机并申请专利，由于该样机完成一次提取仅用时30 s左右，与其他传统方法相比可谓相当之迅速，故又称之为“闪式提取器”，与之相呼应的植物组织破碎法也被称“闪式提取法”。其后，该技术又经历了十余年的应用与发展。2007年，刘延泽[7]对闪式提取法的基本原理、提取操作的实现过程以及闪式提取器的构造、优势与应用等方面进行了系统论述。闪式提取法也需要溶剂参与，故其是溶剂提取法的一种，其通过闪式提取器的高速搅拌、振动、负压渗滤3种外力的组合[8]，使有效成分从植物组织中迅速渗透释放、溶出并转移至所用溶剂中，最后通过过滤，使操作者达到提取目的。除去闪式提取法以外，溶剂提取法中还有加热回流法和超声辅助提取法这两种广泛适合学生使用的方法，因此文章后续会主要采用这两种方法与闪式提取法作比较。加热回流提取法是目前应用较广泛的一种方法，其操作简单、材料成本低，常用作学生的实验用具。加热回流提取法溶媒用量较少，提取较完全，但对于受热易破坏的成分存在一定局限性。一般情况下使用有机溶剂且加热时间长，不适用于热敏性的原料成分的浸出。组织破碎提取法是在室温和适当溶剂存在下使用，且耗时极短，有效避免了有效成分因受热而遭到破坏[9]。与闪式提取法相比，加热回流法加热时间长、耗材消耗大，具有明显的缺点。超声提取法通过物理机械效应、空化效应、热效应等多种因素结合，以达到高效提取药材中的有效成分的目的。超声提取法和闪式提取法都具有提取效率比较高的特点[10-11]，但比较所用时间，组织破碎提取法在1分钟甚至数秒钟内即可提取出药材中70% 左右的有效成分[12]，而超声提取法一般需要使用几十分钟乃至数小时之间，才提取出药材80%左右的有效成分，所以从所用时间和效率相比，组织破碎提取法快速、稳定，又能起到节能降耗的作用[13]，也更有可能适合批量生产。

2 不同材料分别在闪式提取法和其它提取法下提取总黄酮的研究结果

在部分药材植物组织上使用闪式提取法提取总黄酮，与使用其它方法提取总黄酮其结果、结论对比如下。

2.1 银杏叶的总黄酮提取

2.1.1 闪式提取法

赵宏等[14]采用闪式提取技术，以银杏的干燥叶为原材料，设置乙醇体积分数为60%，将一定重量干燥银杏叶粉碎后放入闪式提取器，提取时间为30 s，料液比为1:20，经过一次提取，得到银杏叶总黄酮的最高提取率为1.99%。

2.1.2 其它提取法

李凤梅等[15]采用复合酶酶解法，以新鲜银杏叶为原材料，105 ℃杀青15 min后烘干至恒重，然后放入中草药粉碎机中粉碎，过60目筛，以纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶为复合酶，得出最佳工艺条件为酶用量0.4%，纤维素酶/果胶酶/半纤维素酶的配比2:3:1，酶解温度为40 ℃，酶解时间120 min，pH 5. 5时对银杏叶的总黄酮提取率为3.58%。冯靖等[16]采用微波-超声辅助联合提取技术，以银杏叶为原材料，打磨成粉过60目筛，测得最佳试验条件为料液比1:20，微波时间2 min，超声时间 4 min，超声功率228 W的条件下，得到黄酮类化合物的最佳提取量为24.3095 mg/g，响应面与实际值相差0.05%。罗教等[17]采用超声辅助提取法，经试验后得到最佳工艺条件为70%的乙醇，1:30的固液比，保持75 ℃下超声20 min。此工艺条件下 总黄酮提取率为2.781%。闫高颖等[18]研究水浸提法提取银杏叶总黄酮，试验得出的最佳提取工艺条件为料液比1:26，保持100 ℃，浸提1 h，提取次数为3次。刘雯等[19]在超临界二氧化碳 萃取银杏叶总黄酮甘醇的夹带剂试验中，以夹带剂类型、加入方法、加入量及流速等为条件进行了实验，得到最高提取率为5.03%。

2.2 淫羊藿的总黄酮提取

2.2.1 闪式提取法

贺石麟等[20]研究闪式提取法对淫羊藿中总黄酮的最佳提取工艺条件，经实验得闪式提取法各因素对总黄酮提取效果的影响程度依次为：提取次数>提取时间>液固比>乙醇体积分数，最佳提取工艺为25倍量50%乙醇提取3次，每次10 min。

2.2.2 其它提取法

金向军等[21]采用回流提取法，通过实验确立最佳提取方案为70 ℃，25倍60%乙醇回流提取2次。张翔等[22]采用超高压提取工艺，确定了超高压提取法制备淫羊藿总黄酮的最佳工艺，结果表明：最佳提取工艺为料液比1:25 g/mL，压力400 MPa，浸泡时间5 min，乙醇体积分数75%(φ)，保压时间12 min。

2.3 菟丝子的总黄酮提取

2.3.1 闪式提取法

杨天鸣等[23]使用闪式提取器对菟丝子中的总黄酮进行组织破碎提取，确定菟丝子中总黄酮闪式提取的最佳提取工艺为：料液比1:8(mg:mL)，以50%的乙醇为溶剂提取8 min。

2.3.2 其它提取法

彭金年等[24]采用常规回流提取法、索氏提取法、微波辅助萃取法及闪式提取法对中药菟丝子进行提取优选出最佳提取方法。结果表明，索氏提取法总黄酮含量最高，微波辅助萃 取法和常规回流提取法总黄酮含量较高，闪式提取法总黄酮含量最低;综合考虑，认为微波辅助萃取法具有高效、省时等优点，提取效果较好。彭金年等[25]采用超声波辅助萃取法提取菟丝子中的总黄酮，经实验研究得最佳工艺条件为乙醇体积分数70%、提取温度80 ℃、提取时间30 min、料液比1:20(g/m L)；秦晶晶等[26]采用回流提取法、冷浸法、超声提取法、微波辅助萃取法、索氏提取法5种方法提取菟丝子中总黄酮含量，5种提取方法所得总黄酮含量从大到小依次为回流提取法(31.24 mg/g)、微波辅助萃取法(16.84 mg/g)、索氏提取法(12.82 mg/g)、超声提取法(9.74 mg/g)、冷浸法(8.88 mg/g)，回流提取法所得总黄酮含量最高。林晓等[27]采用微波辅助提取法，菟丝子总黄酮的最佳提取工艺为加入药材量30倍65%乙醇，在40 ℃下超声提取15 min。孙艳玲等[28]采用超声波协同复合酶的方法提取菟丝子中的总黄酮，经实验得最适合的艺参数是pH为4.0，酶解温度为52.6 ℃，超声时间为20.3 min，此时总黄酮提取率为2.34%。

2.4 青龙衣的总黄酮提取

2.4.1 闪式提取法

赵宏等[29]采用闪式提取法，优选闪式提取青龙衣总黄酮的最佳工艺。结果：当料液比为1:20，闪式提取时间为60 s，乙醇体积分数为70%时，青龙衣总黄酮的提取率最高，为11.73%。

2.4.2 其它提取法

孟敏[30]用回流萃取法，经实验得出青龙衣总黄酮的最佳提取工艺为14倍量(mL/g)的60%乙醇，回馏3.0 h，提取1次。王文泽[31]用浸取萃取法，经实验得出青龙衣总黄酮最佳提取工艺为乙醇浓度为30%，提取时间60 min，提取温度60 ℃，料液比为1:30。

2.5 马鞭草的总黄酮提取

2.5.1 闪式提取法

张迪[32]采用响应面法优化马鞭草中总黄酮的提取工艺，运用Box-Behnken设计响应面优化马鞭草中总黄酮闪式提取工艺，结果表明：马鞭草中总黄酮提取的最佳工艺条件为乙醇浓度50%，料液比为1:35 (g/mL)，提取时间为1.5 min，提取次数为2次。在此条件下，总黄酮含量达到(8.282±0.003) mg/g，与模型预测值8.280 mg/g相近。重复性试验结果表明，此方法稳定可靠，总黄酮得率高，适于马鞭草中总黄酮的提取。

2.5.2 其它提取法

卞杰松等[33]采用正交试验设计研究超声波辅助提取马马鞭草中总黄酮的工艺条件测得马鞭草中总黄酮的最佳超声提取工艺条件为乙醇溶液体积分数70%、固液比1:40 (g/mL)、超声功率500 W、超声辅助提取温度70 ℃条件下提取20 min，在此条件下提取率可达2.87%。影响马鞭草中总黄酮提取效果的主次因素为：固液比>超声波功率>提取温度>乙醇体积分数。

2.6 罗布麻叶的总黄酮提取

2.6.1 闪式提取法

白明等[34]使用闪式提取法提取罗布麻叶中的总黄酮，得出最佳工艺为：乙醇浓度55%，料液比1:50 (W/V，g/mL，下同)，提取时间50 s，提取次数2次；在此条件下，最高提取率为4.24%。

2.6.2 其它提取法

潘思源等[35]探究微波辅助离子液体提取罗布麻叶总黄酮的最佳提取工艺，经实验所得最佳工艺为：离子液体浓度0.73 mol/L、液料比19:1 mL/g、微波时间10 min、微波功率483 W、温度70 ℃，此条件下总黄酮提取量的平均值为(14.10±0.202)mg/g，提取量较传统提取工艺有明显提高。韩爱霞等[36]探究了酶法提取罗布麻叶总黄酮的工艺，得出最佳提取工艺条件为：pH值5，酶用量3 mg/g，酶解温度45 ℃，酶解时间2 h，乙醇浓度50%。该条件下总黄酮得率达到4.6%。并得出以纤维素酶酶解预处理后再用溶剂乙醇提取罗布麻叶中的总黄酮得率明显提高的结论。叶菊等[37]采用传统萃取方法对罗布麻叶总黄酮提取工艺进行了研究，得出最佳提取工艺条件为料液比1:10。乙醇浓度65%，提取温度70 ℃，提取时间2 h。

2.7 罗汉松的总黄酮提取

2.7.1 闪式提取法

王全泽等[38]采用闪式提取法提取罗汉松总黄酮，经实验后得出闪式提取罗汉松总黄酮最佳工艺条件为：乙醇体积分数71%、料液比36:1 (mL/g)、提取时间53 s、提取电压为75 V 时，罗汉松总黄酮得率为 8.147%。

2.7.2 其它提取法

黄凤音等[39]采用超声方法提取罗汉松果实中的总黄酮，得出结果最佳提取工艺为料液比1:40，用75%乙醇超声提取60 min。郑玉蓉等[40]优选D101型大孔吸附树脂分离纯化罗汉松叶总黄酮的工艺条件，经实验后得出大孔树脂分离纯化罗汉松叶总黄酮的最佳工艺条件为：上样浓度4.00 mg/mL，上样流速2.0 mL/min，体积分数80%乙醇以2.0 mL/min速率洗脱，回收率为 60.80%。

2.8 马尾松的总黄酮提取

2.8.1 闪式提取法

陈良胜[41]研究马尾松中黄酮的闪式提取工艺并与黄酮乙醇回流法对照差别，得出闪式提取最佳工艺是85%乙醇，料液比1:12，提取时间3.0 min；闪式提取黄酮的含量经UV测定高于乙醇回流提取法。

2.8.2 其它提取法

张卫丽等[42]采用有机溶剂法提取马尾松中的总黄酮，结果表明：单因素试验中，最优提取条件为70%乙醇溶剂、提取时间1.5 h、料液比1:40。

此外，以总黄酮类的二氢黄酮柚皮素为例，现有的提取法除了传统的有机溶剂萃取法和回流萃取法以外，人们对酸水解法[43-49]、超临界CO2萃取法[50-52]、酶水解法[53-54]亦存在一定研究。

3 讨 论

综上所述，闪式提取法在总黄酮的提取上具有耗能小、器材简便易得、对环境污染小、流程简单、易操作、提取时间极短等诸多优点，其提取率明显高于传统的有机溶剂萃取法，但可能低于微波辅助萃取法、超声辅助萃取法与回流萃取法。因此，提高闪式提取法在植物总黄酮上的提取率是有价值的。本文就闪式提取法提取条件综述，唐镜等[55]对柚皮素提取研究进展的综述结论，我们可以作出闪式提取柚皮素可能存在的优势如表1所示。

表1 闪式提取柚皮素的优势比较Table 1 Comparison of flash extraction of naringin

由表1可以知道，闪式提取法在对药材的黄酮提取上与其他常用方法有较大不同。在提取时间上，常规回流法、酶解法等方法往往需要数小时的提取时间，而闪式提取法只需要数分钟甚至仅需数十秒。因此，闪式提取法在提取时间上具有明显显著的优势。

在设备成本上，超临界CO2和超高压法需要的设备最为昂贵且日常维护成本较高；闪式提取法由于需要专用的闪式提取器，所以设备成本较大，但与前两者相比又很少，所以是中间一级；回流法、酶解法、水解法等等由于主要只用到基本的玻璃器材，所以在设备成本上是最便宜的。因此，闪式提取法的应用需要一定的设备资本。

在提取剂的消耗上，回流法和闪式提取法对试剂的用量最少；超声、微波、超高压法消耗的溶剂次之；酸水解和酶水解消耗的溶剂最多；超临界CO2萃取法因为使用特殊溶剂，所以在这一点上不作讨论。因此，从消耗试剂的成本来看，闪式提取法具有显著的优势。

在提取剂的单价上，超临界CO2法由于使用专门的溶剂，其溶剂成本可以看作昂贵的日常维护成本的一部分，因此超临界CO2法在这上面具有明显劣势。

在提取操作的工艺难度上，超临界CO2法、超高压法、闪式提取法是最简单的；以玻璃仪器为主要仪器的回流萃取法、酸解法和酶解法操作难度较大，对劳动力资源的消耗相对较大。

在安全性能上，各方法因设备成本的高低而差异较大。

在提取效率上，闪式提取法的表现适中，不出色也不逊色与其它各种提取方法。

相较于传统以加热和浸泡的萃取方法，闪式提取法提取速度快了好几个档次且设备风险更小，不易因操作失误而引发实验事故；相较于同样需要需要一定设备资本的微波提取法和超声提取法，闪式提取法由于其提取时间短所以噪声污染相对较小；相较于超临界CO2法和超高压萃取法，闪式提取法又更便宜，材料成本和设备成本相对更低。

4 结 语

闪式提取法相较于其它方法而言，具有提取时间短、耗材量小、成本较低、耗材单价低、节省人工资源等显著优点。但相较于前面的方法，闪式提取法有提取量少、难以投入量产的缺点，其提取效率也并不突出。就目前而言，闪式提取法更适合于在有一定教育资本的学校内作教学使用，方便学生学习对中草药材有效成分的提取的原理，并迅速练习其操作步骤，既能学到知识，又能省去大量的教学时间，将有限的课堂时间从等待萃取转移到到诸如讨论等更有意义的教学活动中去，更加吸引学生注意力，提高教学质量。若能在原方法上加以改进，解决其难以量产的问题，闪式提取法必然会成为极有潜力和的推广价值的中草药有效成分提取方法。若能将其与其它方法联合，经过一定的探究得到能够提高提取效率的闪式辅助提取法，必能为其它方法节省大量时间，优化实验方案。

由此可见，闪式提取法具有显著的特点，其在黄酮类天然化合物柚皮素的提取方面确实值得深入研究。