蜂源幼虫缓慢葡萄球菌的分离鉴定及药敏试验研究

王兵兵，李志远，王心悦，韩小丽，剡根强＞，王 建，冯广余

（1.石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832000；2.新疆农垦科学院，新疆 石河子 832000）

缓慢葡萄球菌（Staphy lococcus lentus）属于微球菌科、葡萄球菌属（Staphy lococcus）。在1976年该菌被Kloos等研究者命名为松鼠葡萄球菌缓慢亚种（Staphy lococcus sciuri subsp .lentus）[1]，直到1983年由Schleifer K H等研究者将其划分为葡萄球菌属的一个独立的种，缓慢葡萄球菌（S.lentus）[2]。

缓慢葡萄球菌属于凝固酶阴性葡萄球菌（Coagulase-negative staphy loco cci，CNS）[1]。CNS是人体皮肤正常菌群之一，以前认为缓慢葡萄球菌不具有致病性，但越来越多的研究表明CNS可引起人类及多种动物发病，成为了不可忽视的致病菌，在人医临床上已成为医院感染的重要致病菌。缓慢葡萄球菌是条件致病菌，特别对于新生幼儿或者患有严重基础性疾病以及长期接受治疗的病人等免疫力相对低下的人群更容易感，感染后如不能及时治疗导致严重后果[3-6]。在动物上引起奶牛乳腺炎、小鼠角膜炎、尿道炎、肺炎等疾病[4,7,8]，目前未见蜂感染该菌的报道。

目前，国内外科研人员对缓慢葡萄球菌的文献报道较少，对其致病机理、感染时机、及临床治疗意义等尚不清楚[3]，被用来进行进一步研究的资料以及菌种资源也十分有限。本研究从死亡熊蜂幼虫中分离鉴定一株缓慢葡萄球菌，并对其进行了药敏试验研究，以期为进一步探讨该菌特性、对熊蜂人工饲养过程中的影响等提供相关资料和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

熊蜂发病幼虫；API鉴定系统细菌鉴定仪，法国生物梅里埃公司产品；革兰氏染液，购买于珠海贝索生物技术有限公司；固体/液体LB培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；药敏试验的药敏纸片购自上海伊化有限公司和杭州天和微生物制剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、2×Easy Taq PCR Super Mix均购买于北京全式金生物技术有限公司；PCR引物为北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离 无菌采取发病幼虫在无菌环境下接种于液体LB培养基，在37 ℃条件下培养24 h后，接种于LB固体培养基37℃进行培养24 h，挑取单个菌落进行革兰氏染色镜检。

1.2.2 生化鉴定试验 采用生化鉴定仪进行生化鉴定。

1.2.3 细菌DNA提取 用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌的基因组DNA。

1.2.4 PCR鉴定 细菌16SrRNA 序列的扩增采用细菌通用引物。

引物序列如下:

正向引物27F:5′--AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG--3′

反向引物1 4 9 2 R:5′--T A C G G(C/T)TACCTTGTTACGACTT--3′

PCR反应体系（25µl）：上下游引物各1 µl，2×Easy Taq PCR Super Mix 12 µl，无菌水9 µl，DNA模板2 µl。PCR反应条件：预变性，95 ℃，5 min；变性94 ℃，30 s，退火55 ℃，45 s，72 ℃延伸90 s，32个循环；72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物用1 %琼脂糖凝胶进行电泳检测。PCR产物经电泳验证片段大小与预期相符合后，送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序并比对测序结果。

1.2.5 药敏试验 药敏试验采用药敏纸片扩散法进行头孢他啶、庆大霉素和克林霉素等21种常用抗生素的抗菌敏感性测试37 ℃培养20 h后测量各药物的抑菌圈大小，以判断各种药物对该菌的敏感性。

1.2.6 同源性比较 运用DNAStar软件的MegAlign程序进行多重序列同源性比对。

1.2.7 系统进化树构建 应用Mega5.0分析软件进行分析，通过Neighbor-Joining方法构建遗传系统进化树。

表1 生化鉴定

2 结果

2.1 形态及培养特性

分离菌株SHZXF1为革兰氏阳性球菌，散在、多个聚集在一起分布（见图1）。LB固体培养基37℃培养24 h后，形成灰白色的边缘整齐、圆形凸起、表面湿润光滑的菌落（见图2）。

图1 分离菌镜检形态（革兰染：10×100）

图2 分离菌在LB琼脂平板上菌落形态

2.2 生化鉴定

生化鉴定结果见表1。

2.3 PCR鉴定

经琼脂糖凝胶电泳检测，分离菌株（SHZXF1）DNA PCR扩增产物片段在1 000～1 00 bp之间，与预期目的片段1 400 bp相符（见图3）。

图3 PCR产物凝胶电泳

2.4 同源性比较

将分离菌SHZXF1 16SrRNA 基因序列在NCBI上进行核苷酸同源性比对，结果显示分离菌SHZXF1与Gen Bank登录的中国黑龙江（EF528296.1）、智利圣地亚哥（EU794392.1）、英国北爱尔兰（FJ794392.1---FJ795683.1）、印度（KM010146.1，KT26062.1）、法国（LC383925.1）等多株缓慢葡萄球菌同源性均达99.2%以上（见图4）。

2.5 系统进化树

图4 16SrRNA基因核苷酸序列与参考序列同源性比对

将分离菌SHZXF1 16SrRNA 基因序列与在NCBI登陆的缓慢葡萄球菌基因序列进行遗传进化树构建，结果显示分离菌SHZXF1与中国黑龙江（EF528296.1）、智利圣地亚哥（EU794392.1）、英国北爱尔兰（FJ794392.1---FJ795683.1）、法国（LC383925.1）聚为同一支，与印度（KT260602.1、KT260615.1）聚为一大支（见图5）。

图5 16SrRNA基因核苷酸序列与参考序列系统进化树

2.6 药敏试验

药敏试验结果见表2。

表2 药敏试验

3 讨论

葡萄球菌属包含30多种葡萄球菌，但是只有3种葡萄球菌有细胞色素C而呈氧化酶阳性反应，松鼠，缓慢和解酪葡萄球菌[9]。缓慢葡萄球菌与松鼠葡萄球菌的生物学特性非常相近，曾属于松鼠葡萄球菌的迟缓亚种，缓慢葡萄球菌与松鼠葡萄球菌区别在于分解棉子糖阳性。解酪葡萄球菌与松鼠葡萄球菌区别在于分解木糖、纤维二糖、甘露醇反应阴性[8]。因此，依靠细菌的特殊生化特性，可以对氧化酶阳性葡萄球菌作出鉴定。

缓慢葡萄球菌一度只被认为是寄生在山羊和绵羊皮肤及粘膜上的正常菌群[10]，但是，近年来更多的研究表明，该菌跟一些疾病的发生有着密切的联系，盛相鹏等报道了缓慢葡萄球菌可以造成仓鼠的全身性菌血症，并可以导致小鼠的慢性死亡；刘福来等研究表明缓慢葡萄球菌可以造成猪肺炎，引起死亡的病原菌[4,5,8,9]。

本研究从生病的熊蜂幼虫中分离得到缓慢葡萄球菌，通过与16SrRNA基因进行了PCR鉴定及基因同源性比较分析，结果发现，该分离株与中国黑龙江、智利圣地亚哥、英国北爱尔兰、印度、法国等多株缓慢葡萄球菌同源性均达99.2%以上，这也说明，缓慢葡萄球菌虽然在世界多国存在，但是彼此之间的基因差异性极小。药敏试验研究表明，该分离株对多种抗生素敏感，可能是因为在目前我国熊蜂人工饲养阶段还没有过多使用抗生素来进行疫病防治。这也为以后熊蜂人工饲养期间疫病的防控提供了理论依据。

缓慢葡萄球菌与多种疾病密切相连，受到越来越多的关注，但是目前国内外对缓慢葡萄球菌的研究较少，特别是在蜂上的研究未见报道，其对蜂的致病性及临床意义有待进一步的研究，这对蜂病的防控及安全健康养殖具有重要意义。