对分光光度法测定饲料中总磷含量标准的修订

商 军，华贤辉，张浩然，田 恺，张亦菲，徐 汀

(上海市兽药饲料检测所，上海 201103)

磷是动物必须的常量元素，其作为骨骼的组成元素，在骨骼中的含量仅次于钙，对动物健康和生长有着不可缺少的作用。动物所需的磷元素主要来源于饲料，只有在饲料的加工过程中添加足量的含磷物质才能保证不影响动物的生长，其含量也是作为评价饲料营养品质的重要指标[1-3]。磷的测定方法已有许多研究，如气相色谱法[4]、X射线荧光光谱法[5-6]、等离子体原子发射光谱法[7]等，但这些方法多数需要特定的仪器设备，测定方法较繁琐，应用还不广泛。分光光度法是测定磷元素最广泛的分析方法，已应用于饲料、食品、土壤、水质、肥料等试样中磷含量的测定[8-12]。

目前饲料中总磷含量测定执行的是新发布的国家标准GB/T 6437—2018《饲料中总磷的测定 分光光度法》，由于原国家标准GB/T 6437—2002使用了多年，根据使用情况的反馈，有必要进行修订。为此，按照全国饲料工业标准化技术委员会的要求，承担了对原国家标准GB/T 6437—2002的修订(国家标准项目计划编号：20140321-T-469)，主要增修订内容为：(1)增加了方法的检出限和定量限；(2)增加了磷标准贮备液保存期；(3)删除干灰化法中“不适用于含磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2)的饲料”的内容；(4)修订了标准曲线的线性范围(由原标准的0～16 μg/ml修改为0～15.00 μg/ml)。上述增修订内容经试验验证，修订后方法更为准确可靠，适用性更强，结果令人满意。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UV-2550紫外-可见分光光度计，带1 cm石英比色皿，岛津企业管理(中国)有限公司；AB135-S电子天平，精度为0.01 mg，瑞士METTLER TOLEDO公司；M104箱式马弗炉，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；ED56电热干燥箱，德国Binder公司；SLK 2红外线加热板，维根技术(北京)有限公司；Molatom 1810A纯水机，中国重庆摩尔水处理设备有限公司。

硝酸、高氯酸、盐酸、磷酸：分析纯，永华科技(江苏)有限公司；磷酸二氢钙：按无水物计，Ca(H2PO4)2的质量分数为92%，磷的质量分数为24.4%，Merck公司；盐酸溶液：1+1(V1+V2)；50 μg/ml磷标准贮备液：取105℃干燥至恒重的磷酸二氢钾，置干燥器中，冷却后，精密称取0.219 5 g，溶解于水，定量移入1 000 ml容量瓶中，加硝酸3 ml，加水稀释至刻度，摇匀，即得，置聚乙烯瓶中4℃下可储存1个月；钒钼酸铵显色剂：称取偏钒酸铵1.25 g，加水200 ml加热溶解，冷却后再加入250 ml硝酸，另称取钼酸铵25 g，加水400 ml加热溶解，在冷却的条件下，将2种溶液混合，用水稀释至1 000 ml，避光保存，若生成沉淀，则不能继续使用；试验用水：GB/T 6682中规定的三级水；饲料样品来自于市场收集。

1.2 试验方法

1.2.1试样前处理

1.2.1.1干灰化法

称取试样(2～5)g，精确到1 mg，置于坩埚中，在电炉上小心炭化，再放入高温炉，在550℃灼烧3 h(或测粗灰分继续进行)，取出冷却，加盐酸溶液10 ml和硝酸数滴，小心煮沸约10 min，冷却后转入100 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，为试样溶液。

1.2.1.2湿法消解法

称取试样(0.5～5)g，精确到1 mg，置于凯氏烧瓶中，加入硝酸30 ml，小心加热煮沸至黄烟逸尽，稍冷，加入高氯酸10 ml，继续加热至高氯酸冒白烟(不得蒸干)，溶液基本无色，冷却，加水30 ml，加热煮沸，冷却后用水转入100 ml容量瓶中并稀释至刻度，摇匀，为试样溶液。

1.2.1.3盐酸溶解法(适用于微量元素预混料)

称取试样(0.2～1)g，精确到1 mg，置于100 ml烧杯中，缓缓加入盐酸溶液10 ml，使其全部溶解，冷却后转入100 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，为试样溶液。

1.2.2磷标准工作液的制备

准确移取磷标准贮备液0、1、2、5、10、15 ml于50 ml容量瓶中(即相当于含磷量为0、50、100、250、500、750 μg)，于各容量瓶中分别加入钒钼酸铵显色剂10 ml，用水稀释至刻度，摇匀，常温下放置10 min以上，以0 ml磷标准溶液为参比，用1 cm比色皿，在400 nm波长下用分光光度计测各溶液的吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制工作曲线。

1.2.3试样测定

准确移取试样溶液(1～10)ml(含磷量(50～750)μg)于50 ml容量瓶中，加入钒钼酸铵显色剂10 ml，用水稀释至刻度，摇匀，常温下放置10 min以上，用1 cm比色皿，在400 nm波长下用分光光度计测定试样溶液的吸光度，通过工作曲线计算试样溶液的磷含量。若试样溶液磷含量超过磷标准工作曲线范围，应对试样溶液进行稀释。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

按“1.2.2”项下制备成的磷标准工作液，分别选择在400、420、430、440 nm处用分光光度计测各溶液的吸光度。以磷溶液浓度(x)为横坐标，吸光度值(y)为纵坐标，绘制工作曲线。得出不同波长下测得的标准曲线线性参数，结果见图1。由图1可知，测定时选择吸收波长400 nm，标准曲线的线性相关性最好且吸光度值较大，灵敏度高，选择400 nm为检测波长是适宜的。

图1 不同检测波长处测定的磷标准曲线比较图

2.2 磷标准贮备液保质期的确定

取在冰箱中4℃保存的磷标准贮备液(50 μg/ml)，按“1.2.2”项下分别制备成1.0 、5.0和15.0 μg/ml标准工作液，分别在0、1、7、14、21、28、35、40、50 d测定由磷标准贮备液制备成的上述标准工作液3个浓度点吸光度值随放置天数的变化情况，结果见图2。试验结果表明，制备的标准工作液3个浓度点吸光度值随放置天数的变化情况为：0～35 d内，3个浓度点的吸光度值基本变化不大，但35 d后，吸光度值有显著变化，考虑到方法的普适性，故确定磷标准贮备液(5.0 μg/ml)在4℃冰箱中保存的时间为1个月是较为适宜的。

图2 磷标准贮备液的稳定性试验图

2.3 待测试样和标准溶液放置稳定性的确定

在400 nm 吸收波长下，选择试样溶液(含磷量5.6 μg/ml)和磷标准溶液(含磷量5.0 μg/ml)，在(0～120)min进行时间扫描试验，绘制时间-吸光度曲线，结果见图3。试验结果表明，随着静置时间的延长，试样溶液(含磷量5.6 μg/ml)和磷标准溶液(含磷量5.0 μg/ml)吸光度值变化较小，放置10 min后，在110 min内吸光度基本稳定，表明显色反应所生成的络合物较为稳定。

图3 待测溶液放置时间-吸光度曲线图

2.4 磷酸二氢钙对干灰化法测定饲料中总磷的影响

2.4.1饲料中添加磷酸二氢钙回收率试验结果

为了考察磷酸二氢钙对干灰化法测定饲料中总磷的影响，按“1.2.1.1干灰化法”对不同饲料样品进行了加标回收率试验，其中玉米称样量约为5.0 g，豆粕、畜配合饲料和畜浓缩饲料约为2.5 g，水产配合饲料约为2.0 g，畜禽用复合预混合饲料约为1.0 g，采用添加磷酸二氢钙(按无水物计)3个不同浓度水平(折算成磷的浓度为：2.32、4.64和9.28 μg/ml)进行试验，每个水平平行测定5次，结果见图4。试验结果表明，回收率为95.2%～106.3%，RSD为0.4%～3.2%，添加磷酸二氢钙对饲料产中总磷测定无影响。

图4 样品添加磷酸二氢钙3个不同浓度水平的回收率试验结果分布图

2.4.2饲料中添加磷酸二氢钙后不同称样量对总磷测定的影响

为了考察饲料中添加磷酸二氢钙后不同称样量对总磷测定的影响，取添加磷酸二氢钙(折算成磷的浓度为9.28 μg/ml)的玉米、水产配合饲料、畜浓缩饲料、畜禽用复合预混合饲料，分别称取约2.0、2.5和5.0 g进行试验，每个称取水平平行测定3次，按“1.2.1.1干灰化法”对不同饲料样品进行了测定，结果见图5。试验结果表明，饲料中添加磷酸二氢钙后不同称样量对总磷的测定无影响

图5 饲料中添加磷酸二氢钙后不同称样量对总磷测定的影响

2.5 方法学验证

2.5.1线性范围

按“1.2.2”制备成的0、1.00、2.00、5.00、10.00和15.00 μg/ml的磷系列标准工作液，在400 nm处用分光光度计测定标准系列溶液的吸光度值。以磷溶液浓度(C)为横坐标，吸光度值(A)为纵坐标，绘制标准曲线，试验结果表明，在质量浓度为(0～15.00)μg/ml时，线性关系良好，相关系数(r)均大于0.999 9。

2.5.2检出限(LOD)和定量限确定(LOQ)

以扣除空白值后的吸光度为0.01相对应的浓度值为检出限，以3.3倍检出限浓度作为定量限，其测定值的相对标准偏差(RSD)约为15%[13]。

式中，a为标准曲线的截距；b为标准曲线的斜率；V为试样的体积。

定量限确定=3.3×LOD。按不同时间段测的标准曲线分别计算检出限和定量限，结果见表1。由表1可知，不同时间段绘制的标准曲线计算的检出限和定量限分别为(0.001 08～0.001 33)μg/ml和(0.003 56～0.004 39)μg/ml；当取样量5 g，定容至100 ml时，检出限和定量限分别为(10.8～13.3)mg/kg和(35.6～43.9)mg/kg，根据标准在实际使用中的考虑，将检出限定为20 mg/kg，定量限定为60 mg/kg是合理的。

表1 检出限和定量限测定结果

2.5.3精密度试验

取磷含量不同的饲料样品按“1.2.1试样前处理”和“1.2.3试样测定”处理，分别测定5次，测定结果见表2。由表2可知，试样中磷质量分数≤0.5%时，相对标准偏差(RSD)在2.0%～2.9%，试样中磷质量分数>0.5%时，RSD在0.8%～1.2%，方法的精密较好，符合饲料检验对精密度的要求。

表2 方法精密度的试验结果(n=5)

2.5.4回收率试验

为了考察方法准确度，分别按“1.2.1试样前处理”对不同饲料样品进行了加标回收率试验，其中鸡肉骨粉、豆粕、畜配合饲料、畜浓缩饲料称样量为2.5 g，畜禽用复合预混合饲料约为1.0 g，畜禽用微量元素预混合饲料约为1.0 g，采用3个不同水平的添加量，每个水平平行测定3次，结果见表3。由表3可知，回收率为94.6%～98.2%，RSD为1.8%～4.1%，方法具有较好的准确度。

表3 方法的加标回收率试验结果(n=3)

2.6 试样测定

为了考察方法适用性，按修订后的方法对各类饲料产品中总磷的含量进行了测定，每个平行测定3份。RSD为0.1%～2.9%，均小于3%，结果见表4。

表4 各类饲料产品中总磷的测定结果(n=3)

续表

3 结论

修订后的方法，经试验验证，方法的线性范围、回收率、测定的精密度、检出限和定量限等技术指标均较好，应用于实际各类饲料产品中总磷含量的测定，结果准确、可靠、具有很高的稳定性。