乙醇/磷酸氢二钾双水相体系提取洋葱黄酮工艺条件研究

肖连冬，王莹，李慧星

（南阳理工学院生物与化学工程学院，河南 南阳 473004）

黄酮类化合物是在植物中分布非常广泛的一类天然产物[1]，现已确认结构的生物黄酮类物质约有5 000 种[2]。不同结构的黄酮可以作用于身体的不同器官，黄酮作为一种强抗氧化剂，其功效是多种多样的，不仅可以清除体内的氧自由基，还能够阻止细胞的衰老和退化，降低癌变的可能性，具有抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎、镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗辐射等作用[3-6]。洋葱又名葱头、圆葱、球葱，作为生活中常见的蔬菜，洋葱不仅含有丰富的维生素和氨基酸，而且还含有大量黄酮类化合物，洋葱中的黄酮类物质主要有黄酮类、黄酮醇类和花色素类，作为洋葱中重要的活性物质，有着广泛的生理活性作用[7-11]。因此，探索洋葱黄酮提取方法、条件对有关功能食品开发、营养保健品生产及医药临床治疗方面有意义重大。

黄酮传统的提取方法有水浸提法，乙醇浸提法和酶解浸提法等。水浸提法操作最为简便，对环境影响较小，但效率低，收率低，杂质含量高；乙醇溶液浸提法耗时长，收率低；酶解法条件温和，但耗时长，成本高[12]；双水相萃取法，是一种新型液-液萃取技术，根据萃取体系性质不同，当物质进入双水相体系后，由于其表面电荷、表面自由能和各种力的作用使其在上下两相进行分配，从而得以分离[13]。其优点[14-15]：（1）双水相萃取兼具提取和纯化双重功效，提取出的产物纯度高，杂质少；（2）操作条件温和；（3）界面张力小，利于两相间物质传质；（4）分相时间短，萃取效率高；（5）操作简便，易于工业化等。因此该方法受到人们极大的关注，是一种很有发展前途的萃取方法。本试验采用双水相萃取法，研究乙醇/磷酸氢二钾双水相体系萃取洋葱黄酮的工艺条件，确定各项主要技术参数，以期为洋葱黄酮的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红皮洋葱：市售；槲皮素（分析标准品）：上海金穗生物科技有限公司；无水乙醇、磷酸氢二钾、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠等均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

BSA124S 分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；FW-100 高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；TDL·40B 台式离心机：上海安亭科学仪器厂；DHG-9146A 电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；SHA-C 水浴恒温振荡器：金坛市杰瑞尔电器有限公司；721 分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

将洋葱洗净、切丝，放入干燥箱中50 ℃干燥后用粉碎机粉碎，过40 目筛。

1.3.2 双水相相图的绘制

采用浊点滴定法[16-17]绘制双水相相图。参照溶解度大小，配制质量分数为25%的磷酸氢二钾溶液。向锥形瓶中加入一定质量的磷酸二氢钾溶液，后滴加无水乙醇并充分振荡至溶液浑浊，记下无水无醇质量，然后滴加蒸馏水至溶液澄清，记录蒸馏水的质量，算出此时磷酸氢二钾和乙醇在系统中的质量分数，即得相图中的一个点。重复上述操作，绘制出相图。

1.3.3 槲皮素标准曲线的绘制

准确称取5 mg 槲皮素标准品溶解定容至25 mL，得到 0.2 mg/mL 的黄酮标准溶液。分别吸取 0、1、2、3、4、5、6 mL 黄酮标准溶液，各以50 %乙醇溶液补至6 mL，然后各加入1 mL 5%亚硝酸钠溶液，混匀，静置6 min；再分别加入1 mL 10%硝酸铝溶液，混匀，静置6 min；再加入10 mL 1 mol/L 氢氧化钠溶液，充分混合后用50%乙醇定容至20 mL，静置15 min。以0 mL 黄酮标准液试管为空白，在510 mm 下测定各个溶液的吸光值，建立标准方程，绘制标准曲线[18-19]。

1.3.4 洋葱黄酮提取操作

在乙醇/磷酸氢二钾双水相体系中，上相为富乙醇相，下相为富盐相，由于黄酮类物质极性较小而富集于上相，而极性较大的物质如多糖则多富集于下相，从而使洋葱黄酮得以提取分离。收集上相中黄酮作为产物进行研究。具体操作为：配制总质量10 g 的双水相体系，加入一定量洋葱粉末，恒温水浴振荡萃取后，将其转移到离心管，4 000 r/min 离心20 min，测定上相体积及黄酮含量，计算出提取率。

式中：Vt为上相体积，mL；Ct为上相黄酮浓度，mg/mL；M 为加入的洋葱粉末的质量，g。

1.3.5 单因素试验

以上相黄酮提取率为主要指标，分别考察不同因素对洋葱黄酮提取效果的影响。

乙醇质量分数确定：在磷酸氢二钾质量分数为18 %，加料量为 0.5 g，40 ℃提取 20 min 条件下，考察双水相体系中不同乙醇质量分数（36%、38%、40%、42%、44%）对洋葱黄酮提取效果的影响。

磷酸氢二钾质量分数确定：在乙醇质量分数为40 %，加料量为 0.5 g，40 ℃提取 20 min 条件下，考察双水相体系中不同磷酸氢二钾质量分数（16%、18%、20%、22%、24%）对洋葱黄酮提取效果的影响。

加料量确定：在乙醇质量分数为40%，磷酸氢二钾质量分数为18%，40 ℃提取20 min 条件下，考察不同洋葱粉加量（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g）对洋葱黄酮提取效果的影响。

提取温度确定：在乙醇质量分数为40%，磷酸氢二钾质量分数为18 %，加入0.5 g 洋葱粉，提取时间20 min 条件下，考察不同温度（30、40、50、60、70 ℃）对洋葱黄酮提取效果的影响。

提取时间确定：确定乙醇质量分数为40%，磷酸氢二钾质量分数为18%，加料量为0.5 g，考察40 ℃下提取不同时间（10、20、30、40、50 min）对洋葱黄酮提取效果的影响。

1.3.6 乙醇/磷酸氢二钾体系提取洋葱黄酮的Box-Behnken 试验

在单因素试验的基础上，选择加料量（A）、乙醇质量分数（B）、磷酸氢二钾质量分数（C）3 个因素作为变量，以洋葱黄酮提取率（Y）为响应值，设计响应面优化试验，确定黄酮提取的最佳条件。提取温度选择50 ℃，时间选择30 min。Box-Behnken 试验设计因素水平表见表1。

表1 Box-Behnken 试验因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

2 结果与分析

2.1 槲皮素标准曲线

以不同含量的槲皮素在波长510 nm 处的吸光值A510nm为纵坐标，以槲皮素含量为横坐标，绘制标准曲线，结果见图1。

图1 槲皮素标准曲线Fig.1 Standard curve of quercetin

由图1 可知，在槲皮素含量0～1.2 mg 范围内，标准曲线线性回归方程为y=0.478 4x-0.007 2，R2=0.999 5。结果表明，槲皮素含量与吸光值呈良好的线性关系。

2.2 双水相体系相图绘制

利用浊点滴定法绘制乙醇/磷酸氢二钾双水相体系相图见图2。

根据相图，在两相区内选择数据进行洋葱黄酮提取试验。

图2 乙醇/磷酸氢二钾双水相体系相图Fig.2 Phase diagram of EtOH/K2HPO4 aqueous two-phase system

2.3 洋葱黄酮提取的单因素试验

2.3.1 乙醇质量分数对洋葱黄酮提取效果的影响

乙醇质量分数对洋葱黄酮提取的影响结果见图3。

图3 乙醇质量分数对洋葱黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol mass fraction on extraction rate of onion flavonoids

乙醇质量分数大小直接影响双水相体系组成，从而影响黄酮萃取效果。由图3 可知，在磷酸氢二钾质量分数一定的情况下，随着乙醇质量分数的增加，黄酮提取率逐渐增加，在42%时达到最高，当乙醇质量分数继续增加黄酮提取率显著降低。其原因是当乙醇浓度较低时不利于黄酮的浸出，随着体系中乙醇质量分数增加，使上相中乙醇浓度增加，有利于黄酮浸出，同时上相体积逐渐增大[20]，下相体积相对减小，总提取率增大。随着乙醇质量分数的持续增加，上相的极性减小，一些脂溶性有机物的溶出量也会增加，抑制了总黄酮的浸出。

2.3.2 磷酸氢二钾质量分数对对洋葱黄酮提取效果的影响

不同质量分数的磷酸氢二钾对洋葱黄酮提取影响结果见图4。

磷酸氢二钾质量分数高低对双水相体系组成有影响，从而影响对洋葱黄酮萃取效果。由图4 可见，在乙醇质量分数一定的情况下，随着磷酸氢二钾质量分数增加，黄酮提取率先升后降，当磷酸氢二钾质量分数为22%时提取率最高。这可能是由于当磷酸氢二钾质量分数增加时，体系中水分的质量分数相应变小，同时盐对水的争夺量也增加，上相乙醇浓度相对增加，对黄酮的浸取能力增大，但盐的增加会导致下相的体积增大，相比减小[21]，过多影响体系整体的萃取能力，从而导致提取率的下降。

2.3.3 加料量对洋葱黄酮提取效果的影响

加料量对洋葱黄酮提取效果的影响结果见图5。

图4 磷酸氢二钾质量分数对洋葱黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ammonium dipotassium hydrogen phosphate mass fraction on extraction rate of onion flavonoids

图5 加料量对洋葱黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of feed quantity on extraction rate of onion flavonoids

由图5 可知，加料量在0.1 g 时黄酮提取率较低，在0.3 g 时提取率达最高，然后随着加料量的继续增加，黄酮提取率逐步降低。其原因可能来自于两方面的作用，其一是在双水相体系质量一定情况下，随着加料量增加溶剂渗透并扩散到细胞内的速度以及黄酮化合物向溶剂中扩散的速度小，所以提取率下降；其二是干洋葱粉的加入会吸收双水相中的部分水分，使乙醇浓度有所提高，所以当加料量特别少时，提取率也较低。上述结果为两者综合影响的结果。

2.3.4 提取温度对洋葱黄酮提取效果的影响

提取温度对洋葱黄酮提取的影响结果见图6。

图6 提取温度对洋葱黄酮提取率的影响Fig.6 Effect of extraction temperature on extraction rate of onion flavonoids

由图6 可知，提取温度为50 ℃时提取率最高，随着温度的升高，提取率不断下降，这是因为乙醇受热时易挥发，使得双水相系统萃取能力下降，从而影响提取率。因此优化试验选取最佳提取温度为50 ℃。

2.3.5 提取时间对洋葱黄酮提取效果的影响

提取时间对洋葱黄酮的影响结果见图7。

图7 提取时间对洋葱黄酮提取率的影响Fig.7 Effect of extraction time on extraction rate of onion flavonoids

由图7 可见，随着提取时间的延长，黄酮提取率先升后降，在提取时间为30 min 时达到最大。原因可能是提取初期，洋葱黄酮随时间增加不断浸出，随着提取时间的延长，总黄酮的浸出率逐渐达到最大。如果继续延长时间，乙醇挥发量增加，会引起总黄酮提取效果下降。同时长时间提取还可能造成黄酮类化合物的内部分子结构的破坏[22]，使得黄酮提取率随之而降低。试验结果表明，选择当超声提取时间为30 min 时，黄酮提取率最高。因此在进行优化试验时，选取提取时间为30 min。

2.4 Box-Behnken试验设计与响应面试验分析

双水相体系提取洋葱黄酮的Box-Behnken 试验结果见表2。

表2 Box-Behnken 试验设计与结果Table 2 Design and results of Box-Behnken test

利用Minitab 软件对试验数据进行分析，所得回归方程系数显著性检验结果见表3。

表3 回归系数显著性分析Table 3 Significance analysis of regression coefficients

由表3 可知，自变量A、B、C 3 个因素对黄酮提取率的影响大小关系为A＞B＞C，即：加料量＞乙醇质量分数＞磷酸氢二钾质量分数；其中加料量（A）对结果达到极显著水平，乙醇质量分数（B）则达到显著水平；加料量、乙醇质量分数和磷酸氢二钾质量分数的曲面效应（A2、B2、C2）对结果有极显著影响；加料量和磷酸氢二钾质量分数的交互作用（AC）对提取率有显著影响。各因素回归拟合后得到回归方程：Y=5.304 17-0.353 975A-0.137 613B-0.022 762 5C-0.590 758A2-0.786 333B2-1.157 98C2+0.046 875AB+0.196 525AC+0.116 35BC。

模型的方差分析结果见表4。

表4 模型方差分析Table 4 Variance analysis of model

根据表4 回归模型方差分析结果，模型P＜0.000 1，表明该二次方程模型具有高度的显著性；失拟P=0.183＞0.05，表明模型失拟项不显著；该模型决定系数R2=0.990 6，调整决定系数R2Adj=0.973 8，说明模型拟合度较好，可用该模型预测黄酮在不同工艺条件下的提取率。经过软件分析可知，3 个因素的极点值对应最优水平分别为：A=-0.313 1，B=-0.107 7，C=-0.042 0，即当加料量为0.24 g、乙醇质量分数为41.78%、磷酸氢二钾质量分数为21.92%时洋葱黄酮提取率最高，在最优条件下双水相萃取洋葱黄酮，理论最高提取率达到5.367%。考虑到实际操作及因素对结果影响大小，加料量取0.24 g，将乙醇质量分数调整为41.8 %，磷酸氢二钾质量分数调整为22 %，在50 ℃下提取30 min，进行3 次平行试验，该验证试验的提取率平均值为5.321 9%，接近预测值，表明本响应面优化设计合理可行，该回归方程能够反映各因素与黄酮提取率的影响。

3 结论

本研究利用双水相萃取法提取洋葱黄酮，考察了乙醇质量分数、磷酸氢二钾质量分数、加料量、提取温度和时间对洋葱黄酮提取率的影响。通过采用响应面试验分析优化了洋葱黄酮的提取条件，得到洋葱黄酮最佳提取工艺参数为：加料量为0.24 g，乙醇质量分数41.8%，磷酸氢二钾质量分数22%，提取温度为50 ℃，提取时间为30 min，此条件下洋葱黄酮的提取率达5.32%。试验利用乙醇/磷酸氢二钾双水相体系提取洋葱黄酮具有浸出率高、节约时间、提取效率高、无污染等优点，可为洋葱黄酮的工业化生产提供理论依据。