白桑椹柠檬果酒发酵工艺研究

尹爱国，曾霞，程水明，岳茂峰，彭舒

（广东石油化工学院广东高校果蔬加工与贮藏工程技术开发中心，广东 茂名 525000）

桑椹（Morus alba L.）是桑科（Moraceae）桑属（Morus）落叶乔木桑树的果实，有黑桑椹和白桑椹类型[1]。桑椹鲜果可食用，味甜汁多，富含多种人体所必须营养成分（有机酸、抗氧化作用的VE和VC、类黄酮类的花色苷、白藜芦醇、多种矿物质元素等），是人们常食的水果之一，且具一定药用价值，是国家颁布的“药食两用”水果之一[1]。桑椹具有抗氧化、增强免疫力、调节血脂、抗辐射等作用，有益于延缓机体衰老，有望开发成降脂保健功能食品或辅助治疗药物[2-5]，应用前景好。目前对桑椹研究主要聚焦在黑桑椹，主要是利用黑桑椹加工成果酒、果酱等产品[6-9]。白桑椹虽然花色苷含量低，但其营养价值不低于黑桑椹[10]，其果实硕大，果肉细腻，浓甜如蜜，食用性更强[11]，但因白桑椹为天然浆果，皮薄，水分和糖分多，季节性强，鲜果难储藏，有关白桑椹的相关研究及加工利用报道极少，深入研究与开发白桑椹资源就显得十分必要与迫切。

桑椹酒是近些年来新兴起的保健果酒，酒体富含氨基酸、多酚、有机酸等成分[12-13]，既可充分开发利用现有的桑椹资源，提升桑椹种植业的经济效益，又可增加酒类品种，丰富果酒市场。目前，对桑椹酒的研究主要集中在黑桑椹发酵工艺和营养分析等方面，而对白桑椹酒发酵研究近乎空白[14-16]。为利用白桑椹营养及资源优势，延长蚕桑产业链，促进蚕桑产业转型升级，本研究从果汁体积比、发酵温度、糖度、SO2浓度、发酵液pH 值及接种量等方面探讨它们对白桑椹与柠檬果酒发酵的影响，通过单因素试验，采用正交设计试验优化果酒发酵工艺参数，酿出口感纯正、风味独特的白桑椹柠檬果酒，为白桑椹资源综合利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白桑椹：品名“白玉王”，茂名市蚕业技术推广中心；柠檬：品种“Eureka”，市售；SY 型酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；白砂糖：市售。

1.2 仪器设备

PAL-1 数显糖度计：日本ATAGO 爱宕公司；ZYBIO-5L 发酵罐：上海紫裕生物科技有限公司；PHS-3C pH 计：上海雷磁仪器厂；BSP-250 生化培养箱：长春博迅生物技术有限责任公司；SY-2 型错流膜过滤器：绍兴海纳膜技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 白桑椹柠檬酒酿造工艺流程

白桑葚柠檬果酒酿造的主要工艺流程如下。

操作要点：

1）挑选原料：摘除未成熟果，挑取颗粒饱满、无病虫害、无腐烂的成熟果实作为酿酒用原材料。

2）榨汁：白桑椹及柠檬用清水冲洗后，分别榨汁，果汁备用。

3）调配果汁：经处理后的果汁按设计比例混合后，用食用级白砂糖及柠檬酸调整复合果汁的起始糖度和pH 值。

4）杀菌：在榨汁后的白桑椹汁和柠檬汁中分别加偏重亚硫酸钾，盖罐密封放置24 h。

5）酵母活化：取发酵用酵母于100 mL2%糖水中，摇床培养（37 ℃，1 h），备用。

6）接种：将活化酵母按设计量加入到调配好的复合果汁中。

7）主发酵：将接种后的发酵液置于不同设计温度下发酵7 d。定期取样测糖含量，依据糖含量变化确定发酵进程。

8）过滤：主发酵结束后，将发酵液用专用滤网进行分离，留滤液。

9）密封陈酿：分离后酒液采用密封、避光陈酿，为防止酒液氧化，尽量满罐封藏，减少酒体和空气接触，4 ℃陈酿 30 d。

10）过滤除菌：陈酿后果酒采用错流膜过滤器过滤，留滤液，检测相关指标。

11）灌装：过滤除菌酒液在无菌条件下灌装。

1.3.2 发酵工艺参数筛选的单因素试验

设计白桑椹与柠檬汁比（白桑椹100%，柠檬为0～10%，按 2 %幅度递增）、起始糖度（16 %～26 %，按2 %幅度递增）、起始pH 值（2.7～4.2，按0.3 幅度递增）、主发酵温度（15 ℃～30 ℃，按 5 ℃幅度递增）；SO2浓度（0 mg/L ～75 mg/L，按 15 mg/L 幅度递增）及接种量（0.2%～2.2%/V/活化酵母，按0.4%幅度递增）为考察因素，每24 h 取样，测发酵液中总糖含量，依据总糖含量变化确定发酵进程。陈酿结束后，测发酵液总糖含量、酒精度、挥发酸、总酸，探讨因素变化对白桑椹柠檬果酒发酵程度及风味影响大小。

1.3.3 基本指标测定方法

总酸参照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》用酸碱滴定法测量[11]；pH 值参考GB10468-1989《水果和蔬菜产品pH 值的测定方法》用电位差法测定；酒精度、挥发酸（以乙酸计）参考GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》用酸碱滴定法测定；总糖采用PAL-1 数显糖度计直接测定；微生物通过GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》和GB 4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》中的MPN 法分别进行测定。

1.3.4 感官评定

参考文献[1]、[17]方法进行，感官评定小组由10人组成，成员均经过培训（男女各半），评价项目指标及描述如表1[18]所列。评价小组在品尝前需嗅闻待评测酒样，每酒样（20 mL）在20 ℃下被随机编号和品尝，每个酒样平行测定3 次，评价成员的评价单独进行，评价分数分为 10 个等级：0 分（极弱）～100 分（极强）。

表1 白桑椹柠檬果酒感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standards of white mulberry-lemon wine

1.3.5 正交设计试验

在单因素试验结果上，以感官评分作为基础，各理化检测作为标准，综合考虑对发酵品质影响的主因素进行正交试验，确定白桑椹柠檬果酒优化工艺组合。

1.3.6 数据处理

酒精度、总酸、挥发酸及总糖含量均为平行测定数据 3 次，Excel 2007 和 SPSS20.0 对数据进行分析；采用Origin 9.0 进行作图。

2 结果与分析

经检测，桑椹果汁呈亮红色，色泽鲜亮，糖度14%，可溶性固形物（soluble solids content，SSC）11.5%，总酸（以柠檬酸计）3.81g/kg，pH 值3.72，菌落总数 65 CFU/mL，大肠菌群未检出；柠檬果汁呈乳黄色，均匀混浊状，可溶性固形物（SSC）37.5%，总酸（以柠檬酸计）18.81 g/kg，菌落总数385 CFU/mL，大肠菌群12 MPN/100 mL，霉菌及酵母7 CFU/mL，致病菌未检出。

2.1 白桑椹柠檬果酒工艺优化单因子试验结果

2.1.1 白桑椹与柠檬汁复合比对果酒品质影响

调整发酵液糖度为24%，pH 3.6，接种量1%，白桑椹与柠檬汁体积比分别为 100∶2、100∶4、100∶6、100∶8、100∶10，25 ℃恒温发酵 7 d，定期取样测发酵液中总糖、酒精度、挥发酸及总酸含量，考察白桑椹与柠檬汁复合比对果酒发酵影响，结果见图1。

由图1 知，桑椹汁与柠檬汁比例为100∶4（体积比）时，酿酒酵母发酵速度快，酒精度最高，达13.8%vol，残糖量最低，为8.8%，形成酒香浓郁、口感丰满、典型性强的白桑椹柠檬果酒。考虑到果汁比对发酵影响不明显，故在正交试验中果汁复合比将不作为主因素，在后续研究中白桑椹与柠檬汁体积比均设定为100∶4。

图1 白桑椹与柠檬汁复合比对白桑椹柠檬果酒品质的影响Fig.1 The effect of the ratio of white mulberry and lemon juice on the quality of mulberry wine

2.1.2 SO2添加量对复合果酒品质的影响

调节糖度为24%，pH 3.6，接种量1%，加入偏重亚硫酸钾使果汁中 SO2终浓度分别为 15、30、45、60、75 mg/L，25 ℃发酵，主发酵结束后取样测发酵液中总糖、酒精度、挥发酸及总酸含量，检验SO2浓度对果酒发酵效果的影响，结果如图2。

由图2 知，随SO2量增加，杂菌去除越彻底，果酒品质提高；当添加超45 mg/L 时，反而抑制酵母生长，产生涩苦味，不利香气形成。考虑到SO2浓度对整个发酵影响不明显，在正交试验中不作为考察因子进行考虑，后续试验中SO2浓度均设定为45 mg/L。

图2 SO2 添加量对白桑椹柠檬果酒品质的影响Fig.2 The effect of SO2 addition on the quality of compound white mulberry wine

2.1.3 酵母接种量对复合果酒品质的影响

调整糖度为24%，pH3.6，分别接入0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%活化酵母，25 ℃恒温发酵 7 d，取样测酒精度、总酸、挥发酸及发酵液中残余糖含量，考察酵母接种量对果酒发酵影响，结果见图3。

图3 结果表明，当接种量过小时，酵母菌生长缓慢，繁殖速率下降，对糖的利用水平亦随之下降，使得发酵液中总糖含量过高。当接种量在0.2%～1.0%区间时，发酵液中残余总糖的量随接种量增加而下降，将接种量增至1.4 %时发酵液中残余总糖的量反而上升。若继续增加接种量，残余总糖的量又下降，但酒精含量亦降低，可能是因酵母旺盛的生长繁殖消耗了大部分糖，而导致酒精产量降低。考虑到接种量对发酵影响不大，故正交设计试验中将不作为考察因素进行考虑，在后续试验中将酵母接种量固定为1.0%。

图3 初始酵母接种量对白桑椹柠檬果酒品质的影响Fig.3 The effect of initial yeast inoculation quantity on quality of compound white mulberry wine

2.1.4 起始糖度对果酒品质影响

将复合果汁起始糖度分别调至16%、18%、20%、22%、24%、26%，起始 pH 值为 3.6，接种量 1%，25 ℃恒温发酵7 d，定期取样测发酵液中总糖、酒精度、挥发酸及总酸含量，测试起始糖度对发酵效果的影响，结果如图4。

由图4 可看出，当起始糖度为24%时，发酵液最终酒精度最高，达到13.9%，但残余总糖量亦达8.9%。糖是酵母生长时的碳源和能量来源，厌氧时酵母能将葡萄糖转化为乙醇，但当起始糖度过高时则会导致发酵液产生较高渗透压而不利于酵母生长繁殖，使发酵不彻底[12]。由图4 残余糖量变化知，发酵液起始糖浓度越高，发酵后残余糖量亦愈高，说明糖酒转化效率低。当起始糖度达到26 %，发酵液最终的残余糖量达10.2%。综合考虑各方因素，将发酵液起始糖度确定为24%较为适宜。

2.1.5 起始pH 值对果酒品质影响

调整发酵液起始 pH 值分别为 2.7、3.0、3.3、3.6、3.9、4.2，起始糖度 24%，25 ℃恒温发酵 7 d，定期取样测发酵液中总糖、酒精度、挥发酸及总酸含量，考察起始pH 值对桑椹果酒发酵的影响，测定结果见图5。

由图5 知，起始pH 值为3.6 时，酒精度达最大值13.5%，对应残糖量最低，为8.2%。而当起始pH 值为3.9 时，酒精度达13%，残糖量8.5%。说明pH 值为3.6～3.9 环境中酵母生长旺盛，对糖利用较为彻底。当pH 值达4.2 时，发酵液酒精含量下降明显，残糖量升高，这可能是因为在该pH 值条件下，易感杂菌而不利于酵母生长，正交优化时，起始pH 值确定为3.3、3.6和3.9。

图4 起始糖度对白桑椹柠檬果酒品质的影响Fig.4 Effects of initial sugar content on the quality of mulberry wine

图5 起始pH 值对白桑椹柠檬果酒品质的影响Fig.5 Effects of initial pH value on the quality of mulberry wine

图6 发酵温度对白桑椹柠檬果酒品质影响Fig.6 Effects of fermentation temperature on the quality of wine

2.1.6 发酵温度对果酒品质影响

调整发酵液起始糖度24%，起始pH 值3.6，于15、20、25、30 ℃恒温发酵 7 d，定期取样测发酵液中总糖、酒精度、挥发酸及总酸含量，考察发酵温度对发酵影响，结果见图6。

从图6 可发现随发酵温度升高，发酵液中糖的消耗速率亦增加，发酵时间相应地缩短。当温度升至25 ℃时，酒精度最高，达到13.7%，但发酵液中残存的总糖量亦较高，为8.2%，进一步提高发酵温度，果酒的酒精度含量下降明显，其原因可能为温度高，酵母繁殖快，代谢旺盛，但高温亦会使酵母较早衰亡，从而缩短发酵的周期[14-15]，导致糖的利用效率下降；温度低会抑制酵母生长繁殖，使得发酵启动缓慢，不利于糖的转化，且易滋生杂菌。综合考虑，将主发酵阶段温度定为25 ℃较为适宜。

2.2 正交试验结果

为优化白桑椹柠檬果酒酿制工艺，在单因素试验结果上，在确定白桑椹柠檬果汁体积比为100∶4、接种量0.035%（以干酵母量计）、SO2添加量45 mg/L 条件下，以起始糖度（A）、起始 pH 值（B）和主发酵温度（C）为影响主因子，以感官评分（Y）为指标值进行正交设计试验，探讨主因子因素和水平对果酒品质影响，确立果酒酿造优化工艺，并在优化工艺条件下进行验证试验。正交设计试验因素与水平如表2。

表2 正交设计试验因素与水平设置表Table 2 Factors and levels of orthogonal design experiments

2.2.1 正交试验结果分析

正交试验结果见表3。

表3 白桑椹柠檬果酒发酵正交设计试验结果Table 3 Results of orthogonal experiment for mulberry compound wine fermentation optimization

由表3 知，对白桑椹柠檬果酒品质影响由大到小顺序依次为：起始pH 值＞主发酵温度＞起始糖度。优化条件为A2B2C3。即起始糖度24%，起始pH 值3.6，主发酵温度25 ℃。

2.2.2 正交试验数据方差分析

正交设计试验结果的方差分析结果如表4。

表4 正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表4可知，pH 值对结果影响极显著（P＜0.01），主发酵温度及起始糖度对结果影响显著（P＜0.05）。

2.3 验证试验

为验证正交设计试验结果准确性，对正交设计试验分析得出的优化条件进行平行验证使验，所酿造出的白桑椹柠檬果酒各项指标分别为酒精度14.0%vol、总酸（以酒石酸计）7.6 g/L、挥发酸（以乙酸计）0.56 g/L、总糖（以葡萄糖计）8.1 g/L、二氧化硫116 mg/L、干浸出物13.2 g/L，未检测出致病微生物及有害金属离子；果酒呈淡红色，具有纯正、优雅、怡悦、和谐的果香与酒香，酒液清亮，酸甜适口，醇厚纯净无异味，酒体完整，具有果酒应有的特征及风味；果酒综合感官评价值为89.7，大于正交设计试验表中的最高感官评价值88.6。可认为本正交设计试验结果有效、可信，表明该最佳工艺条件是合理，可靠的。

3 结论

通过单因素试验及正交设计试验对白桑椹柠檬酒发酵条件进行优化，其优化的酿造工艺参数为：初始干酵母接种量0.035%、添加偏重亚硫酸钾使起始发酵液中SO2浓度为45 mg/L、白桑椹与柠檬果汁体积比为100∶4、起始pH 值3.6、起始糖度24%和主发酵温度25 ℃，在此发酵条件下得到白桑椹柠檬果酒酒体丰满，协调性好，酒香浓郁，典型性好。