燕窝及其伪品电化学指纹图谱的研究

2020-04-28李小玉刘敬杨懋勋赵斌

食品研究与开发 2020年8期

李小玉，刘敬，，杨懋勋，赵斌

（1.中山火炬职业技术学院，广东中山 528436；2.国家中药现代化工程技术研究中心中山健康产品分中心，广东中山 528436；3.珠海大横琴科技发展有限公司，广东珠海 519000；4.珠海霍普金斯医药研究院股份有限公司，广东珠海 519000）

燕窝是金丝燕吐出的丝状胶状物，多产自印度尼西亚、泰国、马来群岛、澳大利亚及中国，具有很高的营养价值和药用价值。燕窝一般由水、脂质、唾液酸、蛋白质、糖类化合物、氨基酸、纤维、无机物质等组成，不同种类燕窝其组成不尽相同。随着燕窝市场不断扩大，燕窝的掺伪鉴别已成为当前研究热点[1-4]。目前，燕窝的鉴别研究主要有图谱鉴别、DNA 鉴别、核磁共振鉴别、显微鉴别，但不管是哪一种方法均存在某种缺陷和不足[4-8]。由于燕窝化学组成复杂，通过分离活性物再进行仪器分析鉴定的方法往往需要复杂的前处理过程。

目前，利用电化学振荡反应获取中药材指纹图谱，常用作中药材的鉴别。其中以溴酸盐为代表的别洛索夫-扎鲍廷斯基化学振荡反应（Belousov-Zhabotinskii osciliating reaction，B-Z）体系最为常见，体系由BrO3--Org-M+-H+-丙二酸组成，其中Org 为有机底物，M+为金属离子催化剂，通常是Ce4+/Ce3+、Mn3+/Mn2+、Fe（Phen）33+/Fe（Phen）32+等[9-10]。

试验以BrO3--Ce2+-H+-丙二酸为振荡体系，燕窝水解液为耗散底物，在恒定温度、搅拌速度的条件下得到具有特征波形的电化学指纹图谱，并利用指纹图谱特征参数鉴别燕窝及其伪品。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

OrigaFlex500 型化学工作站：法国欧力加公司；232 型甘汞参比电极、DJS-1C 型铂黑电导电极：上海精密科学仪器有限公司；150mL 玻璃反应器、DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器：河南矛华仪器有限公司。

硫酸：广州万从化工有限公司；硫酸铈铵、丙二酸：国药集团化学试剂有限公司；溴酸钠：天津市光复精细化工研究所；所用试剂均为分析纯，所用溶液均以二次蒸馏水配制。白燕碎、血燕碎、黄燕碎：新加坡龙标燕窝私人有限公司；鱼胶：中智大药房连锁有限公司；海藻酸钠：上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 测定方法

1.2.1 燕窝前处理

燕窝烘干研磨，过120 目筛得到燕窝粉末。称取0.112 0 g 燕窝粉置于玻璃试管，加入5.00 mL 1.0 mol/L硫酸于烘箱中40 ℃下水解12 h，过滤得到燕窝水解液。伪品处理过程同燕窝。

1.2.2 B-Z 振荡反应

将5.00 mL 燕窝水解液、5.00 mL 2.0 mol/L 硫酸、10.00 mL 1.8 mol/L 丙二酸、10.00 mL 0.016 mol/L 硫酸铈铵，置于150 mL 玻璃反应容器内，摇匀，盖好带注射孔和电极的反应器盖。在35 ℃，搅拌速度500 r/min 条件下，加入10.00 mL 1.0 mol/L 溴酸钾，同时以甘汞为参比电极，Pt 黑电极为工作电极，用电化学工作站记录电化学振荡体系的电位（E）随时间（t）的变化曲线。

1.3 电化学指纹图谱

电化学振荡指纹图谱是以中药为底物，通过调整化学振荡体系中各种化学物质浓度和化学反应条件，使其呈现出特征振荡波形，这种振荡波形是振荡体系中所有物质共同相互作用的结果。若固定振荡体系中各化学物质的浓度，而只改变底物的种类和浓度，则获得的振荡波形就是该中药的特征波形[11-14]。典型的振荡反应曲线如图1 所示，可分为3 个部分：诱导曲线、振荡曲线、停振曲线。

图1 电化学指纹图谱及其特征参数Fig.1 The electrochemical fingerprint and its characteristic parameters

选取5 个典型的参数对指纹图谱进行评价。1）诱导时间t0，从加入溴酸钾开始到振荡开始的时间。2）振荡周期tp，完成一次振荡循环所需要的时间，振荡寿命除以峰数。3）振荡寿命td，从振荡开始到振荡结束的时间。4）最高电位Emax，诱导曲线的电位最高值。5）停振电位Emin，体系振荡刚好停止时所对应的电位。利用这些特征参数可以用来定性定量鉴别和评价中药。

1.4 方法重现性及特异性

对同一种燕窝样品进行3 次平行测定，绘制指纹图谱考察方法的重现性。测定不同种类燕窝及其伪品材料，绘制指纹图谱考察测量方法的特异性。

1.5 数据处理

计算指纹图谱各特征参数的相对标准偏差来评价同一种类燕窝电化学指纹图谱的重现性。

2 结果与分析

2.1 振荡反应测定条件的优化

2.1.1 振荡反应温度的确定

燕窝添加量为0.112 0 g，在搅拌速度为500 r/min的条件下，测定不同温度下燕窝水解液的B-Z 电化学振荡指纹图谱，图谱见图2，相应特征参数见表1。

由图2 可知，33 ℃～38 ℃条件下均可得到稳定的电化学指纹图谱。温度对诱导时间、最高电位及停振电位影响不大，而对振荡周期、振荡寿命影响较大。诱导时间变化不大，可能是由于对燕窝进行了水解处理，燕窝活性成分的浸出、扩散相对容易，故振荡反应诱导期短。

图2 温度对燕窝振荡图谱形态的影响Fig.2 Effect of temperature on the oscillation pattern of bird's nest

表1 温度对燕窝振荡图谱特征参数的影响Table 1 Effect of temperature on characteristic parameters of bird's nest oscillation map

由表1 可知，随温度的升高，燕窝指纹图谱振荡周期、振荡寿命都明显减小，这是由于温度升高则振荡化学反应活化能降低，反应的速率加快，使振荡周期和振荡寿命都明显缩小。我们确定最佳温度为35 ℃。

2.1.2 搅拌速度的确定

搅拌速度会影响活性成分参与振荡反应的进程。在 500、800、1 100、1 400 r/min 不同搅拌速度下，测定黄燕水解液的B-Z 电化学振荡指纹图谱，对指纹图谱特征参数进行分析，结果见图3。

图3 搅拌速度对燕窝振荡图谱特征参数的影响Fig.3 Effect of stirring speed on characteristic parameters of bird's nest oscillation pattern

由图3 可知，搅拌速度对诱导时间（缩短30 s）、振荡周期、振荡寿命等参数没有实质性影响，只要能为振荡反应提供物质扩散条件即可。此外，搅拌速度过高易带带入空气到反应溶液中，指纹图谱出现杂峰，甚至得不到稳定指纹图谱。

2.1.3 燕窝添加量的确定

Marcone M F[4]研究表明白燕窝和血燕窝中含有分子量为 20×103～90×103的 5 种糖蛋白。燕窝中还含有丝氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和缬氨酸等，其中白燕窝苯丙氨酸和酪氨酸含量较大[5]。燕窝添加量的不同，则水解液所含不同化学的物质对振荡体系中氧化还原反应的促进及抑制作用也会有所差异。

称取一定量黄燕，加入5.00 mL 硫酸中得到燕窝水解液，全部转移至35.00 mL 振荡反应溶液中，测定不同燕窝添加量条件下的电化学振荡指纹图谱，并比较分析图谱特征参数，结果见表2。

表2 燕窝浓度对燕窝振荡图谱特征参数的影响Table 2 Effect of bird's nest Concentration on the characteristic parameters of bird's nest oscillation map

由表2 可知，在试验条件范围内，电化学指纹图谱诱导时间变化极小。振荡周期和振荡寿命变化较大，均随着燕窝添加量的增加而减小，这是因为燕窝添加量越大，活性组分浓度增加导致在诱导期和振荡期的振荡反应速率增加，振荡周期和振荡寿命自然减小。然而，底物浓度过大则易使振荡周期太小，不易观察，因此我们选择较佳燕窝添加量为0.112 0 g。

2.1.4 燕窝水解时间的确定

燕窝质地坚硬，其中各活性成分的释放比普通中草药困难，按前述方法对燕窝进行预处理，处理时间分别为4、8、12、16 h，考察水解反应时间对振荡指纹图谱特征参数的影响，结果见表4。