超声波辅助提取蓝莓叶总黄酮及对脂氧合酶的抑制

吴桂玲，胡丽，冯定坤，邢焰

（黔南民族师范学院化学化工学院，贵州 都匀 558000）

蓝莓，又名越橘，属杜鹃花科（Ericaceae）越桔属（Vaccinium L.），为常绿灌木。在我国的四川、重庆，贵州、云南等地已有大面积种植，蓝莓果实呈蓝色，具有独特的风味，并且营养丰富，但蓝莓果实价格昂贵，从而限制了蓝莓的广泛应用[1-2]。蓝莓叶作为蓝莓的一种副产品，通常被丢弃，人们很少对它进行开发和利用，已有研究发现蓝莓叶中含有总酚、原花青素等化合物[3-4]，同时还含有大量的黄酮类物质[4]。黄酮类化合物具有较好的抗氧化、抗衰老和增加机体免疫力、降血压、降血糖、以及抗癌、抗肿瘤和抗突变等功能[5-6]，鉴于蓝莓叶的这些功能，现已有把蓝莓叶烘干作为茶饮用。现有研究发现黄酮类化合物在抑制脂肪酶活性等方面也有一定的效果，目前食品和医药品都在重点开发这个领域[7-8]。目前提取黄酮类化合物的方法主要有溶剂回流提取法[1，9]、微波辅助提取法[10-11]、超声辅助提取法[12-14]，超声辅助提取技术的高频振动可以将细胞组织破坏，从而使浸提效果增强，可以使提取效率得到有效提高的同时将提取时间缩短，近年来已很好地用在天然植物有效成分的提取中。

脂氧合酶（lipoxygenase，LOX，ECl.13.11.12），俗称脂肪氧化酶、是广泛存在于哺乳动物、植物和微生物中的一类非血红素铁蛋白。它专门催化具有顺，顺-1，4-戊二烯结构的不饱和脂肪酸的加氧反应，在植物体中脂氧合酶将亚油酸和亚麻酸转化成氢过氧化脂肪酸[15-17]，最后由于其他酶的作用，产生了具有特殊风味的酯类物质[17]，比如说大豆的豆腥味，谷子的陈化[18]，还有研究表明小米中脂氧合酶活性会影响小米的储藏稳定性[19]。茶叶中的LOX 主要在绿茶加工的初期起作用，比如茶鲜叶摊放的时候和杀青的过程中，LOX会影响绿茶的汤色、滋味、香气等品质[20]，但是LOX 的残留量过大会引起干茶的变质。已有研究发现茶叶产生陈味主要是由于茶叶中的LOX 引起的[20]，因此，可以在茶叶加工贮藏中尽可能的抑制LOX 的活性而达到有效贮藏的目的。通过之前的研究发现麻竹叶和马兰根黄酮类化合物可以抑制毛尖茶叶中的LOX 的活性[8，21]，为了开发更多的天然的LOX 抑制剂，本试验以贵州麻江县的蓝莓叶为原料，用超声波辅助提取法提取蓝莓叶中的黄酮类化合物，用正交试验优化提取工艺，以都匀毛尖茶叶为原料，提取了脂氧合酶，将蓝莓叶中的黄酮类化合物对毛尖茶叶脂氧合酶活性进行了抑制性试验。充分利用了蓝莓叶资源并为天然抗氧化剂（黄酮类化合物）的提取及其对LOX 抑制机理的研究奠定了基础，为寻找天然的LOX 抑制剂及研究茶叶的保鲜奠定了一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

蓝莓叶，采自贵州省麻江县，将蓝莓叶洗净置于DHG-9030A 型电热恒温鼓风干燥箱中干燥后取出用高速万能粉粹机粉粹得最终样品；毛尖茶叶采自都匀团山；芸香叶苷（含量≥95.0%）：国药集团化学试剂有限公司；吐温20、纯度为99.9%的亚油酸：阿拉丁；pH 6.3 的麦氏缓冲溶液：黔南民族师范学院化学化工学院301 实验室自配，其他化学试剂均为分析纯。

TU-1901 双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DHG-9030A 型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；FA1204B 电子分析天平：上海精密仪器仪表有限公司；FW200A 高速万能粉碎机：北京科伟永兴仪器有限公司；ps-20 超声波清洗机：深圳市得康科技有限公司；SHZ-D（III）型循环水真空泵：郑州予华仪器制造有限公司；GTR21-1高速冷冻离心机：上海赵迪生物科技有限公司；HH-S型数显恒温水浴锅：巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 芦丁标准曲线制作

将芦丁标准样品在温度100 ℃下干燥直至恒重，准确称取样品0.020 0 g，先加适量无水甲醇，使芦丁完全溶解，再加无水乙醇，定容到100 mL，得到的芦丁标准溶液，浓度为0.20 mg/mL。

从预先配好的100 mL 芦丁标准溶液中分别量取0.00、1.00、2.00、3.00、5.00、7.00、9.00 mL 依次置于 25 mL的容量瓶中，加入1.00 mL 质量分数为5%的亚硝酸钠溶液，充分摇匀，静置6 min；再加入1.00 mL 质量分数为5%的硝酸铝溶液，再次摇匀后，静置5 min；最后加入10.00 mL 质量分数为4 %的氢氧化钠溶液，摇匀，用无水乙醇定容，放置15 min 至20 min，在最大吸收波长500 nm 处测定溶液的吸光度A，以试剂作空白对照，记录数据，用A 为纵坐标，c 为横坐标绘图，得到芦丁标准曲线回归方程为y=10.874 12X+0.008 6，相关系数 R2＝ 0.999 5。

1.2.2 蓝莓叶黄酮类化合物的提取和含量测定

称取处理过的蓝莓叶粉末3 份，每份0.50 g，分别置于3 个锥形瓶中，分别进行超声波辅助提取，将3 份提取液过滤，分别将滤液于5 000 r/min 离心10 min，取5 mL 上清液稀释至50 mL，备用。取适量待测液于25 mL 容量瓶中，按照1.2.1 测定芦丁标准溶液浓度的方法，将蓝莓叶总黄酮溶液置于紫外可见分光光度计中，测定溶液的吸光度A。根据1.2.1 得到的回归方程，根据吸光度A 可以计算出蓝莓叶总黄酮的含量。

1.2.3 单因素试验

对蓝莓叶黄酮类化合物提取条件所涉及到的4 个因素：乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间研究单因素的影响，每个因素选取3 个水平来进行正交试验优化，得出最佳提取条件。1）乙醇浓度设定为40%、50%、60%、70%、80%、90%；2）料液比设定为 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）；3） 提取温度设定为30、40、50、60、70 ℃；4）提取时间设定为 10、20、30、40、50 min。

1.2.4 超声辅助提取工艺因素水平的确定

参照前期单因素试验的结果，超声波辅助提取蓝莓叶中总黄酮的试验主要考察乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取温度（C）和提取时间（D）4 个因素，每个因素选3 个水平，采用L9（34）正交试验，研究4 个因素对蓝莓叶总黄酮提取率的综合影响，最佳提取条件的确定是将蓝莓叶总黄酮提取率定为考察指标。因素水平设计见表1。

表1 超声辅助提取正交试验因素水平表Table 1 The different levels of the factors in orthogonal test with ultrasound-assisted extraction of flavonoids

1.2.5 都匀毛尖茶叶中LOX 的提取

参照王海滨等[22]从茶鲜叶中分离提纯LOX 的方法，略作修改。将新鲜的毛尖茶叶晾干后剪碎，称取10 g 剪碎的茶叶，准确量取200 mL 的麦氏缓冲液与茶叶混匀2 min 后将混合液过滤，取滤液低温高速离心5 min，取上清液，向上清液中加入固体（NH4）2SO4使溶液的饱和度为30%，在冰箱中静置4 h。再次将溶液低温高速离心5 min。取上清液并向其中加入（NH4）2SO4使溶液的饱和度达到70%。将溶液放入冰箱中静置24 h 左右，将溶液低温离心10 min，进行过滤，将沉淀用麦氏缓冲溶液进行溶解，溶液即为茶叶的粗酶液，放入冰箱冷藏备用。

1.2.6 茶叶脂氧合酶活性测定

底物的制备：先配制10 mL 硼酸盐缓冲溶液，使其pH 值为9.0，浓度为0.2 mol/L，然后取吐温200.25 mL分散在缓冲溶液中，边摇动溶液边滴加亚油酸0.27 mL，充分摇匀，使它们混合均匀，再加入一定体积的浓度为1 mol/L 的NaOH 溶液，边加边摇动，直到使整个溶液澄清，将溶液pH 值调到9.0，定容到500 mL 作为底物备用。

用分光光度法测定茶叶脂氧合酶的酶活性[23]。以温度 50 ℃，pH 值为 6.3，15 mL 反应体系，其中底物为亚油酸钠，以最大吸收波长234 nm 处的吸光度值每分钟增加0.001 个单位定义为一个酶活单位。具体操作如下：15 mL 反应体系中含粗酶液1.0 mL，亚油酸钠母液250 μL，以及缓冲液。在水浴中反应，水浴温度为50 ℃，反应 2 min 时测 1 次 234 nm 处的 OD 值，反应4 min 时再测1 次，观察两次OD 值的变化，进行3 次平行试验。以234 nm 处的吸光度值每分钟增加0.001个单位定义为一个酶活单位。

酶活单位计算公式：A=1 000×[OD4min-OD2min]/2

式中：A 为酶活性单位；OD4min为反应4 min 的OD值；OD2min为反应 2 min 的 OD 值。

1.2.7 茶叶脂氧合酶的活性抑制性测定

在15 mL 反应体系中，加入已稀释了的酶液1.0 mL，亚油酸钠底物250 μL，再加入蓝莓叶黄酮类化合物，黄酮类化合物分别取 0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，全部混匀后用pH 值为6.3 的缓冲溶液补足至15 mL，将反应体系在温度为50 ℃的恒温水浴中反应2 min，在紫外可见分光光度计上测定234 nm 处的吸光度，再继续反应2 min，再次测定234 nm 处的吸光度。黄酮类化合物对LOX 的抑制率按下式计算：抑制率/%=[（A0-A1）/A0]× 100

式中：A0为无抑制剂时的酶活力；A1为加抑制剂时的酶活力。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对蓝莓叶总黄酮提取率的影响

在提取温度40 ℃、提取时间20 min、料液比1∶30（g/mL）条件下，研究当改变乙醇体积分数时，蓝莓叶总黄酮提取率的变化结果见图1。

图1 乙醇体积分数对蓝莓叶总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction yield of total flavonoids from blueberry leaves

由图1 可知，当乙醇体积分数从40%开始逐渐增大时，相应的蓝莓叶总黄酮提取率逐渐升高，在乙醇体积分数达到70%时，总黄酮提取率最大，当超过70%再升高时，总黄酮提取率反而降低，因此选择60%、70%、80%为正交试验中乙醇体积分数的3 个水平。

2.1.2 料液比对蓝莓叶总黄酮提取率的影响

固定乙醇体积分数70%、提取温度设定为40 ℃、提取时间定为20 min，进行3 次平行试验，研究当料液比不同时，蓝莓叶总黄酮提取率有什么变化，试验结果见图2。

由图2 可知，当当溶剂用量逐渐增大即料液比逐渐减小时，蓝莓叶总黄酮提取率也相应增大，在料液比 1∶40（g/mL）时，总黄酮提取率最高，之后随着料液比的的减小，总黄酮提取率开始降低，因此选择1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）为正交试验中料液比的 3 个水平。

2.1.3 提取温度对蓝莓叶总黄酮提取率的影响

在固定乙醇体积分数70%、料液比1∶40（g/mL）、提取时间20 min 条件下，研究当超声提取温度不同时，蓝莓叶总黄酮提取率的变化结果见图3。

图2 料液比对蓝莓叶总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ratio of material to liquid on extraction yield of total flavonoids from blueberry leaves

图3 提取温度对蓝莓叶总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield of total flavonoids from blueberry leaves

当提取温度升高时，蓝莓叶总黄酮提取率逐渐增大，当达到一个最大提取率后再升高温度反而降低了，由试验结果可知，总黄酮提取率最大时的温度为60 ℃，因此选择50、60、70 ℃为正交试验中提取温度的3 个水平。

2.1.4 超声时间对蓝莓叶总黄酮提取率的影响

选取乙醇体积分数 70%、料液比 1∶40（g/mL）、提取温度60 ℃时，研究超声时间改变时，蓝莓叶总黄酮提取率的变化结果见图4。

由图4 可知，随着超声时间的延长，总黄酮提取率增大，到30 min 时达到最大值，30 min 之后其提取率反而降低，因此正交试验中超声时间这个因素选择20、30、40 min 3 个水平。

图4 超声时间对蓝莓叶总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of total flavonoids from blueberry leaves

2.2 超声辅助提取正交试验

根据前面单因素试验结果，综合研究乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取温度（C）和超声时间（D）4 个因素对蓝莓叶总黄酮提取率的影响，设计L9（34）正交试验设计，见表2。

表2 超声辅助提取蓝莓叶总黄酮正交试验结果Table 2 The results of the orthogonal test for ultrasonic extraction of total flavonoids from blueberry leaves

由表2 可知，4 个因素对蓝莓叶总黄酮提取率的影响大小顺序为乙醇浓度＞提取温度＞料液比＞提取时间，可知对蓝莓叶总黄酮提取率影响较大的因素是乙醇浓度，对总黄酮提取率影响较小的因素是提取时间。优化的提取工艺条件为A1B3C3D2，即乙醇体积分数60%，料液比 1∶50（g/mL），提取温度 70 ℃，提取时间30 min，按优化工艺条件进行验证试验，经过3 次平行试验，得到蓝莓叶总黄酮的平均提取率为9.56%，比正交试验表中的黄酮提取率都高，说明验证试验结果可靠。

2.3 茶叶脂氧合酶活性测定及蓝莓叶总黄酮对茶叶LOX的活性抑制作用

按照1.2.6 的LOX 活性测定方法测得茶叶脂氧合酶的酶活力A=33.9。按照1.2.7 的LOX 活性抑制测定方法，结果显示在水浴温度为50 ℃，pH 值为6.3 条件下，蓝莓叶黄酮类化合物可以抑制茶叶LOX 的活性，并且随着总黄酮浓度的增大，抑制性也逐渐增强，结果见图5。蓝莓叶总黄酮：IC50=22.3 μg/mL。

图5 蓝莓叶总黄酮对茶叶LOX 的抑制性Fig.5 Inhibition of total flavonoids from blueberry leaves on LOX in tea

通过研究，发现密蒙花中的黄酮类化合物对大豆脂氧合酶有一定的抑制作用[7]，麻竹叶黄酮类化合物也可以抑制毛尖茶叶中的LOX 活性[8]。已有研究发现矢车菊素、矮牵牛素和飞燕草素可能对黑豆LOX 有一定的抑制性[24]。试验发现蓝莓叶总黄酮对都匀毛尖茶叶中的LOX 的也有一定的抑制作用。

3 结论

以乙醇为提取溶剂，超声波辅助提取蓝莓叶总黄酮，在单因素试验的基础上，采用正交试验优化提取工艺，以总黄酮提取率为考核指标，在给定的试验条件下，4 个因素对蓝莓叶总黄酮提取率的影响的主次顺序为乙醇浓度＞提取温度＞料液比＞提取时间，确定的最佳工艺条件为：乙醇体积分数60 %，料液比1∶50（g/mL），提取温度 70 ℃，提取时间 30 min，按优化条件得到蓝莓叶总黄酮的平均提取率为9.56%。相比于常规提取方法，超声波辅助提取法操作简单，还可节省提取时间，降低成本，还提高了总黄酮的提取效率。LOX 的存在会使食品发生色、香、味的劣变，会对绿茶的汤色、滋味、香气等品质产生很重要的影响，还会降低食品的营养价值，因此发现LOX 的天然抑制剂至关重要，本试验发现蓝莓叶中黄酮类化合物也可以抑制毛尖茶叶LOX 活性。这为寻找天然的LOX抑制剂及研究茶叶的保鲜奠定了一定的理论基础，同时还能充分的利用蓝莓叶，避免资源的浪费。