酚化改性木质素与纤维素酶相互作用研究

牟洪燕 黄 瑾 李维英 樊慧明 詹怀宇

（1.华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室，广东广州，510640；2.华南理工大学轻工与食品实验教学示范中心，广东广州，510640；3.新益昌自动化设备有限公司，广东深圳，518103）

木质素对纤维素酶的吸附主要是通过疏水作用、静电作用和氢键作用来实现的。木质素对纤维素酶的吸附亲和力与木质素的化学结构密切相关，如酚羟基、羧酸基等官能团[1]。酚羟基含量与木质素对纤维素酶的吸附能力成正比[2]。改变pH值会显著改变纤维素酶的表面电荷，使木质素与纤维素酶的吸附亲和力发生变化[3]。有研究者提出通过pH诱导木质素表面修饰，以减少其与非特异性纤维素酶的结合，从而促进木质纤维素的酶水解[4]。基于木质素的化学性质和其对纤维素酶的吸附能力，木质素-纤维素酶复合物具有固定纤维素酶的潜在功能[5-6]。姚兰等人[7]对比研究了不同木质素对纤维素酶的吸附作用。刘祖广等人[8]通过苯酚改性硫酸盐木质素得到酚化木质素，并对比研究了改性前后木质素的性能差异。由于酚化木质素含有更多的酚羟基和游离反应位点[9],因此采取酚化改性来提高木质素的反应活性。本研究以间苯二酚和连苯三酚为酚化试剂，分别对桉碱木质素进行了酚化改性以增加酚羟基的含量，比较了不同侧链结构的酚化木质素对纤维素酶吸附的影响。综合分析比较了不同酚化木质素对纤维素酶吸附作用的差异，并对酚化木质素的物化性质进行了表征。

1 实 验

1.1 材料与试剂

桉木片取自博汇制浆厂；间苯二酚、连苯三酚、氢氧化钠、硫酸、乙酸、乙酸钠、丙酮等试剂均取自Sigma-Aldrich公司；赛力二代纤维素酶（Cellic CTec2）取自Novozymes公司。以上所有试剂均为分析纯，无需进一步纯化可直接使用。

1.2 实验仪器

紫外可见分光光度计（UV-1900，美国）；扫描电子显微镜（SEM，EVO18，德国）；凝胶渗透色谱仪（GPC，Agilent 1200，美国）；旋转蒸发器（REE-52AA，上海）；气浴恒温振荡器（THZ-C，金坛成辉仪器）等。

1.3 木质素酚化改性

按照文献[10]从黑液中提取桉碱木质素并用浓硫酸纯化，称取2 g纯化后的桉碱木质素粉末，加入20 g的间苯二酚（或连苯三酚）混合均匀，再加入15 mL丙酮使其溶解。然后使用旋转蒸发器除去丙酮，在室温下加入40 g 的72%浓硫酸，搅拌反应1 h。反应后过滤，并用大量蒸馏水反复洗涤至中性，干燥后研磨得到木质素间苯二酚（或木质素连苯三酚）。

1.4 酚化木质素乙酰化

分别称取1 g 上述制备的木质素间苯二酚（或木质素连苯三酚）与10 mL 乙酰化试剂（乙酰氯与冰醋酸体积比为1∶4），充分混合均匀，在40℃的密闭环境下反应2 h。反应结束后于50℃条件下水浴至溶剂挥发，再加入少量蒸馏水超声清洗5 min，过滤，反复冲洗3～4次，于50℃烘箱低温干燥，研磨得到乙酰化二酚(或乙酰化三酚)[11]。

1.5 木质素对纤维素酶的吸附

准确称取50 mg酚化木质素，依次加入2 mL纤维素酶液和18 mL pH 值为4.8 的乙酸-乙酸钠缓冲液，超声5 min 使其混合均匀。将盛有上述样品的离心管置于50℃、180 r/min 的气浴恒温振荡器，分别于1、3、6、12、24 h 取样，在转速为5000 r/min 下离心10 min，分离得到的沉淀物于35℃烘箱低温干燥。上清液用0.45 μm 滤膜过滤，以考马斯亮蓝为显色剂，在595 nm 处测定紫外吸光度值，根据绘制的“吸光度(y)-蛋白质浓度(x，g/L)”曲线方程（y=12.523x+0.0567，R2=0.9994）计算纤维素酶蛋白含量[12]，用不加纤维素酶的溶液作为空白组。采用相同的方法测乙酰化改性的酚化木质素对纤维素酶的吸附量。吸附量（mg/g）及吸附率（%）计算分别见式（1）和式（2）。

1.6 纤维素酶的脱附及再吸附

移取1.5 中吸附反应3 h 离心后干燥的沉淀物，加入pH 值10 的乙酸-乙酸钠缓冲液，超声混合均匀，于50℃、180 r/min 的气浴恒温振荡器反应3 h，离心后测上清液中酶蛋白含量[12]。采用1.5 中相同步骤测沉淀物对纤维素酶的重复吸附率。脱附率（%）及重复吸附率（%）计算分别见式（3）和式（4）。

1.7 被吸附纤维素酶的滤纸酶活

选取1.5 中吸附3 h 时离心后干燥的沉淀物，依次向离心管中加入50 mg 定性滤纸条和1.5 mL pH 值4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，于50℃、180 r/min的气浴恒温振荡器中振荡30 min。离心后上清液用0.25 μL滤膜过滤，用3,5-二硝基水杨酸(DNS)作为显色剂，在540 nm 处测定紫外吸光度值。根据绘制的“吸光度(y)-葡萄糖浓度(x，g/L)”曲线方程：y=2.9011x-0.1487，R2=0.9993，计算滤纸酶活[13]，并根据式（5）计算吸附酶活保留率（%）。

1.8 SEM分析

采用扫描电子显微镜对木质素微观形貌进行表征。

1.9 物化性质表征

1.9.1 相对分子质量的测定

采用配备Shodex KF-803L柱的凝胶渗透色谱仪测定酚化木质素相对分子质量。流动相四氢呋喃作为洗脱液，流速为1.0 mL/min，注射体积为100 μL。

1.9.2 表面电荷的测定

根据文献[14]测定不同酚化木质素的表面电荷。

1.9.3 酚羟基含量测定

酚羟基含量=总酸基团含量-羧基含量[15]

总酸基团含量的测定：称取约40～60 mg 酚化木质素m1，加入5 mL 0.1 mol/L NaOH 和2 mL 乙醇，85℃下水浴30 min。水浴结束后立刻加入1 mL 10%BaCl2，冷却后定容至25 mL，离心取15 mL 上清液于预先盛有5 mL 0.1 mol/L HCl 的锥形瓶中，加入5 滴甲基红-亚甲基蓝混合指示剂，用0.01 mol/L NaOH 标准溶液滴定，记录滴定前后的体积差V1。总酸基团含量（mol/g）计算见式（6）。

羧基含量的测定：称取40～60 mg酚化木质素m2，加入20 mL 0.2 mol/L 醋酸钙溶液，85℃下水浴30 min，定容至25 mL。过滤，取20 mL 滤液于锥形瓶中，加入5 滴甲酚红-百里酚蓝混合指示剂，用0.01 mol/L NaOH 标准溶液滴定，记录滴定前后的体积差V2。羧基含量（mol/g）计算见式（7）。

2 结果与讨论

2.1 木质素对纤维素酶的吸附

本研究探讨了不同侧链结构的酚化木质素对纤维素酶的吸附作用效果以及酚羟基含量与木质素对纤维素酶吸附影响的关系，结果见图1。从图1 可以看出，纤维素酶的吸附在24 h 达到平衡，木质素间苯二酚和木质素连苯三酚的最大吸附量分别为842.1 mg/g 和911.4 mg/g。已知文献报道木质素的酚羟基含量与木质素对纤维素酶的吸附能力具有正相关性[2]。从图1 可以看出，木质素连苯三酚对纤维素酶的吸附能力强于木质素间苯二酚，这可能是由于木质素不同的化学结构造成的，因为理论上在相同的酚化反应条件下，木质素连苯三酚的酚羟基含量高于木质素间苯二酚。从图1中还可以看出，与酚化木质素相比，乙酰化后的酚化木质素对纤维素酶的吸附能力大幅降低。主要是因为乙酰化能够去除大部分的酚羟基，从而导致乙酰化改性的酚化木质素对纤维素酶的吸附作用显著降低。从而进一步证明了酚羟基含量的变化影响木质素对纤维素酶的吸附作用。

图1 木质素对纤维素酶的吸附能力

2.2 纤维素酶的脱附及再吸附

图1中所示在3 h前木质素间苯二酚和木质素连苯三酚对纤维素酶的吸附速率最快，3 h时其吸附量分别从194.9 mg/g 和259.6 mg/g 提 高 到369.6 mg/g 和513.5 mg/g。因此，选取3 h时吸附纤维素酶的酚化木质素作进一步研究。将吸附纤维素酶的酚化木质素分散在pH值为10的缓冲液中，被吸附的纤维素酶发生脱附行为。Saini等人[3]研究表明调节pH值有利于被吸附纤维素酶的分离，这主要是因为当pH值升高时可以显著改变木质素的表面电荷，带负电荷的纤维素酶和木质素之间的斥力增强，从而减少了纤维素酶的非生产性结合。改变pH值可以促进被吸附纤维素酶与木质素表面的分离，因此是一种经济可行的促进纤维素酶回收利用的方法。

图2 酚化木质素对纤维素酶的脱附与再吸附

图3 桉碱木质素及酚化木质素的SEM图

纤维素酶的脱附率以及被吸附纤维素酶的酶活保留率如图2 所示。从图2 可以看出，木质素间苯二酚和木质素连苯三酚对纤维素酶的脱附率分别为57.3%和30.2%，其重复吸附率分别为第一次吸附能力的72.3%和26.9%。与初始酶活相比，被木质素间苯二酚和连苯三酚吸附的纤维素酶的酶活保留率分别为57%和38%。结果表明，更少的纤维素酶从木质素连苯三酚中释放，是因为木质素连苯三酚中含有更多的酚羟基使负电荷增加，导致被吸附的纤维素酶因较强的静电力而增加，从而使吸附的纤维素酶难以释放。且与木质素连苯三酚相比，木质素间苯二酚对纤维素酶的酶活影响相对较小。

2.3 SEM表征

图3 为桉碱木质素及酚化木质素的SEM 图。从图3 可以看出，酚化木质素表面形态有较大的变化。桉碱木质素并未表现出微球结构，而木质素间苯二酚和木质素连苯三酚均有微球结构，且木质素连苯三酚的微球粒径比木质素间苯二酚的小。从图3（b）和图3（c）均可观察到颗粒的表面布满了微孔，微孔孔径小而密。木质素分子主要表现为细小的颗粒，而且颗粒表面存在一些小孔，这为其物理性吸附提供了可能。

2.4 木质素的物化性质

为进一步解释木质素间苯二酚和木质素连苯三酚对纤维素酶吸附作用的差异，本研究分别对两种酚化木质素进行了物理化学性质分析表征。

采用凝胶渗透色谱法对桉碱木质素及酚化木质素的相对分子质量分布进行了分析，结果如图4 所示。从图4可以看出，木质素连苯三酚的数均相对分子质量（Mn）和质均相对分子质量（Mw）均略高于木质素间苯二酚，说明木质素连苯三酚解聚较为严重。木质素间苯二酚和连苯三酚的相对分子质量分散指数（PD=Mn/Mw）值均低于桉碱木质素。结果表明，木质素的PD 值与纤维素酶吸附能力成反比[16]。木质素的PD 值越低，相对分子质量越大，对纤维素酶的吸附亲和力越高。因此，相对分子质量和PD 值是导致两种酚化木质素对纤维素酶吸附能力不同的原因之一。

图4 木质素的相对分子质量及其分布

本研究测定了酚化木质素表面电荷、羧基含量和酚羟基的含量，结果见表1。从表1 可以看出，桉碱木质素、木质素间苯二酚和木质素连苯三酚的表面电荷分别为-0.83、-1.27、-0.41 mmol/g，木质素间苯二酚表面负电荷高于木质素连苯三酚。结合图1可知木质素间苯二酚对纤维素酶的吸附能力较低。原因是因为酚化木质素表面负电荷越大，与纤维素酶的静电斥力越强，从而导致对纤维素酶的吸附亲和力降低[17]。与木质素间苯二酚相比，木质素连苯三酚的酚羟基含量更多，吸附能力更强，说明酚羟基含量越高，木质素与纤维素酶吸附亲和力越强。结合对纤维素酶吸附结果，通过物理化学检测可知，酚化木质素的相对分子质量、表面电荷和酚羟基含量对纤维素酶的吸附作用效果均有影响，且酚羟基含量在木质素对纤维素酶的吸附中起着极其重要的作用。

表1 木质素的物理化学性质

3 结 论

本研究以间苯二酚和连苯三酚为酚化试剂，分别对桉碱木质素进行了酚化改性以增加酚羟基的含量，比较了不同侧链结构的酚化木质素对纤维素酶吸附的影响。

3.1 酚化改性后，木质素间苯二酚和木质素连苯三酚对纤维素酶的吸附能力均高于桉碱木质素，对纤维素酶的最大吸附量分别为842.1 mg/g和911.4 mg/g，表明酚羟基含量增加可提高木质素对纤维素酶的吸附能力。

3.2 木质素间苯二酚与木质素连苯三酚的脱附率分别为57.3%和30.2%，表明被吸附的纤维素酶更容易从木质素间苯二酚中释放。

3.3 被木质素间苯二酚和木质素连苯三酚吸附的纤维素酶的酶活保留率分别为57%和38%。